本发明专利技术阐述一种过氧化氢酶的制备方法。该制备方法包括以下工艺步骤：（1）原料绞碎，抽提酶原；（2）分级盐溶、盐析，得过氧化氢酶粗品；（3）粗品投料，多重结晶；（4）活化；（5）结晶；（6）透析；（7）冻干。本发明专利技术建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的过氧化氢酶精品效价达4600单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域，涉及药用过氧化氢酶的生化分离技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取过氧化氢酶。
技术介绍
过氧化氢酶是从牛肝脏或猪肝脏中分离纯化得到的一种蛋白酶。它主要的功用有:能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。用传统的方法仅提取过氧化氢酶是相当困难的。2006年7月上海阿敏制药有限公司公开了一种过氧化氢酶的制备方(200610023582.0)，其采用低温酸提、梯度盐析、冰水透析、亲和层析、乙醇醇析的产品工艺，得到过氧化氢酶。2011年1月马忠仁等申请了一种提取过氧化氢酶的方法(200910170682.X)，其采用了 CaC12激活过氧化氢酶原成为过氧化氢酶的同时加入饱和度的(NH4)2S04，使其生成硫酸钙沉淀吸附过氧化氢酶，经过洗脱、盐析、超滤和冻干获得白色的过氧化氢酶的冻干粉末。产品均为过氧化氢酶，没有单纯的过氧化氢酶提取分离纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了生产高质量的过氧化氢酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，提供了一种提取过氧化氢酶方法。本专利技术的技术方案是:利用硫酸溶液将肝脏细胞中含有的酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理，调节PH，硫酸铵分级盐溶、盐析将过氧化氢酶原等沉淀析出，再将过氧化氢酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性过氧化氢酶激活，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干的方法，即可得较高纯度的过氧化氢酶，包括如下步骤: 1、过氧化氢酶粗制生产操作:(1)提取工序:将新鲜的肝脏绞碎成肝浆，称重。按每千克肝浆加入2~3L的0.1-0.2mol/L硫酸溶液，浸渍20~28小时，将浸渍物置滤袋过滤，滤干后弃去滤渣，留取滤液； (2)盐溶工序:浸渍液中加入硫酸铵，达到30~50%饱和度，静置10~16小时，过滤，留取滤液；(3)盐析工序:滤液中加入硫酸铵，达到50~80%饱和度，静置10~16小时，过滤，留取滤饼； (4)每克滤饼加入2~5ml的水溶解，重复上述(2)、(3)操作； (5)每克滤饼用l~3ml的水溶解，然后每克滤饼中加入0.l~lml的饱和硫酸铵溶液，调节 pH 至 4.0-6.0 ； (6)结晶工序:溶液在20~30°C温度中静置24~72小时，有针状糜蛋白酶结晶析出；离心，调节pH至2.0-5.0，每1000ml溶液中加300~400g固体硫酸铵，达到50~80%饱和度，静置12~16小时，抽滤； (7)干燥工序:取沉淀物，干燥，即得过氧化氢酶粗品。2、过氧化氢酶精制生产操作: (1)投料:称取过氧化氢酶粗品，按每克过氧化氢酶粗品加2?4ml的水搅拌溶解，调节pH至3.0±0.5，以助其溶解，搅拌10?16小时；计量溶液体积，按400?500g/L比例加入固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10?16小时； (2)盐溶:将溶液过滤，称量滤饼重量，先按每克滤饼加入2~4ml的水，搅拌溶解后，调节pH至3.0±0.4，再按每克滤饼加入1?3ml的饱和硫酸铵溶液静止沉淀10?16小时； (3)盐析:将溶液过滤，量取滤液体积，加入等体积量的饱和硫酸铵溶液，静置沉淀10?16小时； (4)洗镁:将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重，待活化； (5)活化:称滤饼重量为A千克，将滤饼溶于3A?5A升的0.001?0.01mol/L盐酸溶液，另加入0.5?2mol/L氯化钙溶液A?3A升及pH7.5?8.5硼酸缓冲液4A?6A升，再加入6A?9A升的水，调节pH至7.0?8.0，最后每克滤饼加5?15mg的结晶过氧化氢酶进行活化，将溶液置0?10°C中静置60?80小时进行活化，pH控制在7.0?8.0 ; (6)除钙:活化后的溶液，调节pH至3.0±0.4，再按200?300g/L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在0?10°C中存放32?60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液按150?250g/L加入固体硫酸铵，在0?10°C中静置10?14小时，过滤，得滤饼； (7)结晶:按每克滤饼加入1?2mlpH8.0?10.0硼酸缓冲液，调节pH至8.0±0.4，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，0?10°C时浸于外透液中，结晶3?7天; (8)透析:取出结晶液过滤得结晶物，再按每克结晶物加入1?3ml水溶解，调节pH至3.0±0.5 ;将溶液透析2?4天，去除杂质，每10?14小时左右透析池换水一次，温度控制在0?10°C ； (9)冻干:取出透析液，加入少量硅藻土，抽滤，得滤液，调节pH至6.0±0.4，进冻干机冻干后得结晶过氧化氢酶成品。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是: 本专利技术采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取过氧化氢酶，通过对传统工艺的改进和创新，不仅生产出了高质量的过氧化氢酶，同时又具有简单、低成本等优点。本专利技术已建立起一套规模化的生产工艺，制备的过氧化氢酶精品效价高达2500单位/毫克以上，符合《中国药典》(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1 1、过氧化氢酶粗制生产操作: 1.提取工序: 1.1新鲜的肝脏，用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重15Kg ; 1.2绞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液30L浸渍24小时，在浸渍期中每小时搅拌1次； 1.3将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再用0.125mol/L硫酸溶液15L浸渍1小时，滤干后弃去滤渣； 2.盐溶、盐析工序: 2.1将两次浸渍液合并，体积为44.9L，置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固体硫酸铵242g，达到40%饱和度，共加10.866Kg固体硫酸铵，静置12小时； 2.2过滤，留取过滤液，滤液体积为44L，固体弃去； 2.3在每1000ml清液中加入固体硫酸铵205g，达到70%饱和度，共用硫酸铵9.020kg，静置12小时； 2.4过滤，留取滤饼，称重269.2g，弃滤液； 2.5用807.6ml水溶解，再按2.1,2.2,2.3、2.4步骤分次加固体硫酸铵近40%和70%饱和度沉淀； 2.6取70%饱和度沉淀物，称重178.5g，用267.8ml水溶解，加入89.3ml饱和硫酸铵溶液，并用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.00 ; 2.7将溶液静置25°C恒温箱中48小时，有针状的糜蛋白酶粗品结晶析出； 2.8过滤，母液用0.25mol/L硫酸调节pH至3.0，其体积为328.4ml加入硫酸铵100.8g，静置12小时； 3.干燥工序: 取沉淀物，置真空干燥箱内干燥，即得过氧化氢酶粗品，称重100.0g，即每千克肝脏可得6.67克过氧化氢酶。2、过氧化氢酶精制生产操作: 1.投料 1.1称取过氧化氢酶粗品100.0g，先用300ml纯化水搅本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种过氧化氢酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）原料绞碎，抽提酶原；（2）分级盐溶、盐析；（3）结晶，得过氧化氢酶粗品；（4）粗品投料，多重结晶；（5）活化；（6）结晶；（7）透析；（8）冻干。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘乃山，安迪，刘翠珍，
申请(专利权)人：青岛康原药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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