一种胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料的制备方法技术

一种胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料的制备方法，属于复合生物材料制备领域，包括：胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)体外培养、介孔纳米生物活性玻璃薄膜的制备、胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)的接种。本发明专利技术制得的胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料取材的便利，不涉及社会伦理等问题，可以加快皮肤修复，具有优良的组织修复的功效。

Preparation method of placenta stem cell composite bioactive glass dressing

A method for preparing placenta stem cells combined with bioactive glass composite biological dressing, belonging to the field of material preparation, including: chorionic villi of placenta derived mesenchymal stem cells (CMSCs) cultured in vitro, mesoporous nano bioactive glass films, preparation of chorionic villi of placenta derived mesenchymal stem cells (CMSCs). Inoculation. The placenta stem cell composite biological glass dressing prepared by the invention has the advantages of convenient material sampling, no social and ethical problems, etc., and can accelerate the skin repair and has the advantages of good tissue repair.

【技术实现步骤摘要】
一种胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料的制备方法
本专利技术属于复合生物材料制备领域，具体涉及一种胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料的制备方法。
技术介绍
近年来，具有增殖和分化潜能的干细胞己经成为皮肤组织工程中好的种子细胞。胚胎干细胞在皮肤组织工程中应用研究，为构建组织工程皮肤在皮肤损伤修复的应用提供了理论依据。但是胚胎干细胞在医学应用上存在道德伦理问题和致瘤性等限制因素，而具有多向分化潜能的多能干细胞一一间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)作为良好的种子细胞，在皮肤组织工程研究中倍受关注。以往的研究主要是集中于骨髓来源的BMSCs但BMSCs需要通过骨髓穿刺而获得，且数量随年龄增长而下降，这都限制了BMSCs的应用，且支架材料的选择和应用一直影响该技术发展的重要难题。
技术实现思路
根据现有技术中存在问题，本专利技术采用新生儿娩后“废弃物”的胎盘组织获取CMSCs，并选用生物活性玻璃作为支架材料，制得胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料。本专利技术采用以下技术方案：一种胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料的制备方法，包括以下步骤：步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织，过质量浓度75％的酒精，再用PBS冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm2小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的IV型胶原酶的低糖基础培养基(L-DMEM)中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lOmin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基(L-DMEM)中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)；步骤三：将15g十六烷基三甲基溴化铵溶于500ml35℃的去离子水中，加入3.9g正硅酸乙酯和3.54gCa(NO3)2·4H2O，用硝酸调节pH到2，水解4小时以后，加入0.435gNH4H2PO4并用NH3·H2O调节pH＝10，反应12h后，把温度升到95℃沉化48小时，将反应液离心分离，用去离子水反复清洗，冷冻干燥，得介孔纳米生物活性玻璃；步骤四：将介孔纳米生物活性玻璃按质量浓度为20％溶解于四氢呋喃中，使用超声波震荡对其进行分散，磁力搅拌1h溶解，制得溶液，将溶液在60℃水浴箱中，回流加热，磁力揽拌2h，直至全部溶解；步骤五：将溶液转移至模具中，并迅速放入零下20℃低温冰箱中，待其形成凝胶后，在凝胶化温度下保持2h；步骤六：将凝胶转入4℃冰箱中进行水置换1d，在冷冻干燥机中于-55℃、气压低于50Pa冻干48h，得到介孔纳米生物活性玻璃薄膜；步骤七：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)接种于介孔纳米生物活性玻璃薄膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料。优选的，所述的步骤一还包括：将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm2。优选的，步骤一中所述的PBS中含有质量浓度0.1％的青-链霉素。优选的，所述的步骤六还包括：将介孔纳米生物活性玻璃薄膜置于24孔板中，于放射CO60辐射消毒。本专利技术的有益效果在于：1)胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)具有较强的增殖、分化能力，且取材的便利，不涉及社会伦理等问题的优势，其作为种子细胞在皮肤组织工程中具有极大的运用前景。2)采用本专利技术制得的介孔纳米生物活性玻璃具有较高的孔隙率，具有相互连通的三维结构，以便于细胞的增殖、迁移，为细胞的生长提供足够的营养物质，且生物活性玻璃生物相容性良好，能激活细胞基因，有利于增强细胞的增殖与分化，具有骨诱导和骨传导的作用。作为支架材料，为细胞生长、代谢提供场所，为形成新组织提供适宜的环境，此外还能调控和诱导的分化，形成新的具有功能性的组织和器官。3)本专利技术制得的敷料，可以加快皮肤修复，具有优良的组织修复的功效。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。一种胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料的制备方法，包括以下步骤：步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm2，过质量浓度75％的酒精，再用含有质量浓度0.1％的青-链霉素的PBS冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm2小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的IV型胶原酶的低糖基础培养基(L-DMEM)中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lOmin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基(L-DMEM)中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)；步骤三：将15g十六烷基三甲基溴化铵溶于500ml35℃的去离子水中，加入3.9g正硅酸乙酯和3.54gCa(NO3)2·4H2O，用硝酸调节pH到2，水解4小时以后，加入0.435gNH4H2PO4并用NH3·H2O调节pH＝10，反应12h后，把温度升到95℃沉化48小时，将反应液离心分离，用去离子水反复清洗，冷冻干燥，得介孔纳米生物活性玻璃；步骤四：将介孔纳米生物活性玻璃按质量浓度为20％溶解于四氢呋喃中，使用超声波震荡对其进行分散，磁力搅拌1h溶解，制得溶液，将溶液在60℃水浴箱中，回流加热，磁力揽拌2h，直至全部溶解；步骤五：将溶液转移至模具中，并迅速放入零下20℃低温冰箱中，待其形成凝胶后，在凝胶化温度下保持2h；步骤六：将凝胶转入4℃冰箱中进行水置换1d，在冷冻干燥机中于-55℃、气压低于50Pa冻干48h，得到介孔纳米生物活性玻璃薄膜，并将其置于24孔板中，于放射CO60辐射消毒；步骤七：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)接种于消毒后的介孔纳米生物活性玻璃薄膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料。取200g左右SD大鼠12只，将SD大鼠麻醉后造模处理，背部剃毛消毒灭菌后，剪开5cm直径大小圆形皮肤缺损创面，将实施例制得的胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料植入其中，得实验组；空白对照组在相同创面处，覆盖凡士林纱布。于术后每天观察创面情况，并于30天后进行组织切片HE染色，将实验组、空白组进行比较。实验结果显示，与未加入任何材料的空白对照组相比，本专利技术制得的胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料能够更好更快的修复大鼠皮肤损伤。手术5天后，实验组大鼠背部创面伤口缝线处己经愈合，创面干燥，无分泌物。lOd后，实验组大鼠的创面基本愈合，创口伴有鲜红色的肉芽组织生成，空白对照组创面可见大量脓性分泌物。30天后，实验组的大鼠创面面积缩小，创面完全愈合，创面处己生长毛发，与周围皮肤几乎融为一体；空白对照组创面结痴，暗红色血块，皮肤未修复完成。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织，过质量浓度75％的酒精，再用PBS冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm

【技术特征摘要】
1.一种胎盘干细胞复合生物活性玻璃敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织，过质量浓度75％的酒精，再用PBS冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm2小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的IV型胶原酶的低糖基础培养基中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lOmin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)；步骤三：将15g十六烷基三甲基溴化铵溶于500ml35℃的去离子水中，加入3.9g正硅酸乙酯和3.54gCa(NO3)2·4H2O，用硝酸调节pH到2，水解4小时以后，加入0.435gNH4H2PO4并用NH3·H2O调节pH＝10，反应12h后，把温度升到95℃沉化48小时，将反应液离心分离，用去离子水反复清洗，冷冻干燥，得介孔纳米生物活性玻璃；步骤四：将介孔纳米...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春松，吴长应，
申请(专利权)人：芜湖扬展新材料科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34