骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及骨肉瘤分子标志物及其应用，具体的涉及NPC2基因及其表达产物在制备骨肉瘤诊断试剂中的应用，NPC2抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。发明专利技术人采用生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因NPC2，并通过分子细胞生物学实验证实了NPC2与骨肉瘤具有很好的相关性，在骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，可以作为骨肉瘤分子标志物，在标志物紧缺的骨肉瘤中具有很好的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及骨肉瘤分子标志物及其应用，更具体的涉及NPC2基因及其表达产物在制备骨肉瘤诊断试剂中的应用，NPC2抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
技术介绍
骨肉瘤(Oseteosarcoma)是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。骨肉瘤发病率约为0.3/万，约占恶性肿瘤的0.2％，原发骨肿瘤的15％，发病年龄多为8-25岁，社会危害性极大，其血行转移发生早且发生率高，进展迅速，80％的患者在确诊时己有微小转移灶，从外科治疗到出现肺转移的平均时间为8个月，5年总体生存率低。随着化学治疗、手术技术、骨重建等治疗方法的发展，骨肉瘤保肢治疗己逐渐取代截肢术，5年总体生存率提高到55％-75％。但是，近年来骨肉瘤的治疗遇到瓶颈，尤其是一些转移骨肉瘤，需要研发新的诊断和治疗策略，如何能早发现早预防是骨肉瘤目前急需解决的难题。分子诊断和靶向治疗等技术的发展也为骨肉瘤的诊疗开辟了新的道路。分子标志物的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。骨肉瘤由于发病率低、样本收集困难等原因，没有被深入研究，目前骨肉瘤的分子标志物并不多，亟待寻找更多的分子标志物，为骨肉瘤的临床诊断提供参考，为骨肉瘤患者带来希望。专利技术人对骨肉瘤病例样本及对照进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因NPC2，并且分析结果显示其与肿瘤转移密切相关。进一步，本专利技术通过分子细胞生物学实验证实NPC2与骨肉瘤具有很好的相关性，并且其在骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，可用于制备骨肉瘤辅助诊疗制剂，可以作为骨肉瘤分子标志物，为临床应用奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供检测NPC2基因或蛋白的试剂在制备骨肉瘤诊断制剂中的应用。进一步，检测NPC2在生物学样品中的表达水平是通过检测NPC2部分或全部mRNA和/或检测编码NPC2蛋白的部分或全部氨基酸序列进行。优选的，生物学样品为来源于患者的生物样品，包括细胞、组织等，可以是血液或者尿液等，优选为外周血。进一步，骨肉瘤患病组中NPC2基因或蛋白的表达水平与正常对照组织或者癌旁组织相比，表达水平升高。进一步，骨肉瘤的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测骨肉瘤组织中NPC2基因的表达。荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。用于荧光定量PCR方法检测骨肉瘤中NPC2基因的产品含有一对特异性扩增NPC2基因的引物；所述的基因芯片包括与NPC2基因的核酸序列杂交的探针。进一步，骨肉瘤的诊断制剂包括用免疫方法检测样品中NPC2蛋白的表达。优选的，免疫检测方法检测骨肉瘤中NPC2蛋白表达的为westernblot和/或ELISA和/或胶体金检测方法。酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。进一步，检测NPC2蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售的NPC2单克隆抗体。进一步，试剂盒包括：包被NPC2单克隆抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。进一步，检测NPC2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的NPC2单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗NPC2单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。本专利技术的目的在于提供一种检测骨肉瘤的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒检测基因NPC2，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.7，下游引物序列为SEQIDNO.8。进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的各个类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.7，下游引物序列为SEQIDNO.8。所述内参引物为β-actin内参引物。本专利技术目的是提供了一种骨肉瘤检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测NPC2蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。本专利技术目的是提供了一种检测骨肉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括与NPC2基因的核酸序列杂交的探针。本专利技术的目的在于提供NPC2基因和/或蛋白抑制剂在制备抗骨肉瘤制剂中的应用。进一步，NPC2基因和/或蛋白抑制剂为NPC2的反义寡核苷酸或干扰RNA。进一步，抗骨肉瘤制剂是指可以抑制骨肉瘤细胞中NPC2基因或蛋白的表达的制剂。本领域人员熟知抑制基因或蛋白的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活NPC2基因的抑制基因、激活抑制NPC2基因表达的蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测NPC2基因或蛋白的试剂在制备骨肉瘤诊断制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.检测NPC2基因或蛋白的试剂在制备骨肉瘤诊断制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测NPC2在生物学样品中的表达水平是通过检测NPC2部分或全部mRNA和/或检测编码NPC2蛋白的部分或全部氨基酸序列进行。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，生物学样品为细胞、组织。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨肉瘤的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法和/或基因芯片方法检测样品中NPC2基因表达；或用westernblot和/或ELISA和/或胶体金检测方法检测样品中NPC2蛋白表达。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用荧光定量PCR方法检测样品中NPC2基因表达的产品含有一对特异性扩增NPC2基因的引物；用基因芯片法检测样品中NPC2基因表达的产品含有与NPC2基因的核酸序列杂交的探针；用westernblot和/或ELISA和/或胶体金检测方法检测样品中NPC2蛋白表达含有市售的NPC2单克隆抗体。6.NPC2基因和/或蛋白抑制剂在制备抗骨肉瘤制剂中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，NPC2基因和/或蛋白抑制剂为NPC2的反义寡核苷酸或干扰RNA，优选的，干扰...

【专利技术属性】
技术研发人员：任静，孙锦云，边洋，
申请(专利权)人：北京泱深生物信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11