本发明专利技术涉及一种神经管畸形产前无创诊断分子标志物，包括6个miRNA（miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575和miR-765）和12个蛋白质（前蛋白转化酶枯草溶菌素9、铜蓝蛋白、白血病抑制因子、14-3-3、对氧磷酶、血浆a-球蛋白抑制因子H4、血清S 蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1、胎球蛋白A、淀粉样蛋白P、血浆a-球蛋白抑制因子H2和血小板因子4）。还包括该分子标志物的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检验医学、临床医学、生物技术、生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种神经管畸形产前无创诊断分子标志物，及其作为检测试剂的应用及使用方法。
技术介绍
神经管畸形(neuraltubedefects,NTDs)包括无脑畸形、脊柱裂、脑膨出、脑积水等,是一种严重的出生缺陷。全世界每年有神经管畸形儿30万～40万例，中国发生率明显高于西方国家。神经管畸形病理改变复杂，导致治疗效果很差。近年来，虽然随着孕期补充叶酸的普及率提高，神经管畸形的发生率有所降低。但由于神经管畸形是复杂的多基因疾病，由环境因素和遗传因素共同作用所致，单纯补充叶酸很难预防所有的神经管畸形的发生，目前为止，神经管畸形仍然是常见的出生缺陷之一，脑积水、下肢功能障碍和尿便失禁依然是严重的术后并发症。建立无创的神经管畸形产前诊断新方法，一直是人们不断追求的理想目标。随着影像学技术（超声和MRI）的不断发展使一些有明显结构异常畸形的诊断时间获得提前，但也只能在畸形完全形成后给予诊断，失去治疗和预防的最佳时机，不能达到早期诊断的要求。通过在孕妇血液和尿液中筛选早期诊断的分子标志物,对于建立早期无创诊断新方法具有重要意义。羊水和血清中甲胎蛋白的含量测定可以用于神经管畸形的筛查，但由于甲胎蛋白检测受影响因素较多，包括母亲年龄与体重、怀孕胎龄和病毒感染等，同时甲胎蛋白检测的假阳性和假阴性率也较高。目前尚无理想的神经管畸形产前诊断分子标志物。由于神经管畸形属于多基因疾病，发病机制复杂，影响因素较多，并不能通过单一的特异性标志物来实现准确诊断和疾病程度判定，因此，非常适合利用高通量的基因组和蛋白质组学技术从众多复杂的基因或蛋白质中筛选出一组（数十或数百个）特异性分子标志物，才能更准确进行早期诊断和疾病进展程度判断。因此，我们实验室利用miRNA芯片对神经管畸形孕妇外周血特异改变的miRNA进行筛选，并利用定量PCR进行大样本的验证。利用蛋白质组学（ITRAQ）方法比较神经管畸形胎儿母亲血清与正常孕妇血清的差异表达蛋白质，并利用ELISA方法进行大样本验证。因此，我们发现了一些有临床应用价值的分子标志物，对于神经管畸形的早期诊断和干预具有极其重要的意义。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术是一种神经管畸形产前无创诊断分子标志物，及其作为检测试剂的应用及使用方法，其目的在于解决神经管畸形发病机制复杂，影响因素较多，并不能通过单一的特异性标志物来实现准确诊断和疾病程度判定的问题。技术方案：一种分子标志物，其特征在于：该标志物由6个miRNA和12个蛋白质组成，其中所述的miRNA分别为：miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575、miR-765；所述的蛋白质分别为：前蛋白转化酶枯草溶菌素9、铜蓝蛋白、白血病抑制因子、14-3-3、对氧磷酶、血浆a-球蛋白抑制因子H4、血清S蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D、胎球蛋白、淀粉样蛋白P、血浆a-球蛋白抑制因子H2、血小板因子4。还包括含有该分子标记物的试剂盒。所述的神经管畸形产前诊断生物标志物试剂针对的神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂、脊膜膨出。一种由所述的分子标志物制备的神经管畸形产前诊断生物标志物试剂的使用方法，其特征在于：该方法使用训练的算法来比较生物样品和对照样品之间的miRNA和蛋白质水平的差异，确定神经管畸形分子标志物最佳诊断模型。所述的分子标志物制备的神经管畸形产前诊断生物标志物试剂的使用方法，其特征在于：所述的生物样品包括孕妇血液、尿液、羊水、胎儿标本。优点及效果：本专利技术的这些分子标志物可单独或联合用于先天畸形临床常规筛查，具有巨大的经济和社会效益。附图说明：图1、图2为；人miRNA芯片在神经管畸形孕妇中筛选到17个差异表达miRNA；图3为：荧光定量PCR结果显示miR-142-3p、miR-144、miR-720、miR-575、miR-765、miR-1182和miR-1275表达与正常组比较出现统计学差异；图4为：荧光定量PCR结果显示miR-142-3p、miR-144、miR-720、miR-575、miR-765和miR-1275为怀孕特异性miRNA；图5为：不同孕周神经管畸形孕妇与正常孕妇血清PCSK9水平变化情况；图6为：不同孕周正常孕妇血清PCSK9水平变化趋势；图7为：脊柱裂与正常胎鼠E11-E17血清LIFR水平（*P<0.05，**P<0.01）；图8为：LIFRmRNA在神经管畸形与正常胎儿脊髓组织组的表达情况（*p<0.05）；图9为：6种miRNA（miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575和miR-765）在不同神经管畸形类型中表达情况（CON正常组、SB脊柱裂组、ANE无脑儿组）；图10为：铜蓝蛋白在神经管畸形、唐氏综合症和正常孕妇血清中的表达及ROC曲线；图11为：甲胎蛋白在神经管畸形、唐氏综合症和正常孕妇血清中的表达及ROC曲线；图12为：PCSK9在神经管畸形孕妇血清中表达情况，(a)PCSK9在正常孕妇血清中变化情况，(b)PCSK9在神经管畸形孕妇血清中变化情况，(c)ROC曲线分析，**p<0.01。具体实施方式：本专利技术是一种分子标志物，该标志物由6个miRNA（miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575和miR-765）和12个蛋白质（前蛋白转化酶枯草溶菌素9、铜蓝蛋白、白血病抑制因子、14-3-3、对氧磷酶、血浆a-球蛋白抑制因子H4、血清S蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D、胎球蛋白、淀粉样蛋白P、血浆a-球蛋白抑制因子H2和血小板因子4）组成。本专利技术的应用包括作为神经管畸形产前诊断判的生物标志物试剂的应用，包括制备用于神经管畸形产前筛查、临床诊断和生化检验的试剂盒。所述的神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂、脊膜膨出等。所述的神经管畸形产前无创诊断的生物标本包括孕妇血液、尿液、羊水和胎儿标本等。所述的神经管畸形产前无创诊断的方法包括芯片、质谱技术、MRM、蛋白质组技术、ELISA、PCR、Western-blot、免疫组化、免疫透射比浊法、放射免疫法、催化活性测定法等相关方法。其中使用训练的算法来比较生物样品和对照样品之间的miRNA和蛋白质水平的差异，确定神经管畸形分子标志物最佳诊断模型。标志物中的miRNA分子的筛选：（1）首先利用人miRNA芯片（AgilentTechnologies，SantaClara,CA)在神经管畸形孕妇血清中检测到104个miRNA，在正常孕妇血清中检测到156个miRNA，与正常孕妇相比怀有神经管畸形胎儿的孕妇有12个miRNA出现异常高表达，5个miRNA出现异常低表达（图1所示）。（2）利用荧光定量PCR方法对芯片筛查的差异表达miRNA进行大样本验本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分子标志物，其特征在于：该标志物由6个miRNA和12个蛋白质组成，其中所述的miRNA分别为：miR‑144、miR‑142‑3p、miR‑720、miR‑1275、miR‑575、miR‑765；所述的蛋白质分别为：前蛋白转化酶枯草溶菌素9、铜蓝蛋白、白血病抑制因子、14‑3‑3、对氧磷酶、血浆a‑球蛋白抑制因子H4、血清S 蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D、胎球蛋白、淀粉样蛋白P、血浆a‑球蛋白抑制因子H2、血小板因子4。
【技术特征摘要】
1.一种分子标志物，其特征在于：该标志物由6个miRNA和12个蛋白质组成，其中所述的miRNA分别为：miR-144、miR-142-3p、miR-720、miR-1275、miR-575、miR-765；所述的蛋白质分别为：前蛋白转化酶枯草溶菌素9、铜蓝蛋白、白血病抑制因子、14-3-3、对氧磷酶、血浆a-球蛋白抑制因子H4、血清S蛋白、糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D、胎球蛋白、淀粉样蛋白P、血浆a-球蛋白抑制因子H2、血小板因子4。
2.根据权利要求1所述的分子标志物，其特征在于：还包括含有该分子标记物的试剂盒。
3.一种如权利要求1所述的分子标志物...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁正伟，顾卉，安东，李慧，魏晓伟，刘丹，
申请(专利权)人：中国医科大学附属盛京医院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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