脑卒中的miRNA分子标志物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及脑卒中的miRNA分子标志物及其应用，更具体的涉及mir-4330和/或miR-4330在诊治脑卒中的新用途。发明专利技术通过生物信息学方法对已发表的脑卒中的miRNA高通量转录组数据进行整合分析，选取后备miRNA进行分子生物学验证，RT-PCR结果显示，本发明专利技术提供的miR-4330和脑卒中密切相关，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
脑卒中的miRNA分子标志物及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的涉及脑卒中的miRNA分子标志物及其应用，更具体的涉及mir-4330和/或miR-4330在诊治脑卒中的新用途。
技术介绍
脑卒中是一个症候群，包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。众所周知，脑卒中一旦发生，死亡率极高，而且存活后的残废率高达70％，且复发率极高。根据卫生部公布的统计资料，目前中国约有600万脑卒中残存者，每年新发病例150万，而且发病逐渐年轻化。连续几年来，心脑血管疾病的死亡构成居各类疾病的第一位，占死亡构成的40％以上。而其中单独脑卒中一项的发病率和死亡率一直居第二位，占各类疾病死亡的20％以上。脑卒中传统的危险因素包括年龄、高血压、吸烟、饮酒、糖尿病、高血脂及冠心病史等，但这些传统危险因素只能解释约50％的脑卒中发病，提示存在其它危险因素，如遗传危险因素。寻找脑卒中的致病基因，从分子水平揭示脑卒中的发病机理，可为及早发现脑卒中的危险人群、预防脑卒中的发生提供帮助。miRNAs是内源性非编码的约20-25个核苷酸单链RNA分子。通过结合到相应mRNA3‘非翻译区，诱导mRNA降解或抑制其翻译。miRNAs被报道在多种病理和生理过程发挥关键作用，包括细胞增殖，凋亡，细胞分化，心血管疾病，神经障碍和癌症等。本专利技术通过生物信息学方法对已发表的脑卒中的miRNA高通量转录组数据进行整合分析，选取后备miRNA进行分子生物学验证，RT-PCR结果显示，本专利技术提供的miR-4330和脑卒中密切相关，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供mir-4330和/或其成熟miRNA在制备预防、诊断和/或治疗脑卒中试剂中的应用。mir-4330的序列见序列表SEQIDNO1。mir-4330的成熟miRNA为miR-4330其序列见序列表SEQIDNO2。进一步，预防、诊断脑卒中试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或基于免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸条检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。优选的，基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4330和/或miR-4330的引物；所述的基于探针杂交方法包括与mir-4330和/或miR-4330的核酸序列杂交的探针；所述免疫检测方法包括与miR-4330调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。进一步，检测外周血中mir-4330和/或miR-4330的转录或miR-4330调控的靶基因的表达情况。进一步，所述的治疗脑卒中试剂包括抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。优选的，采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。本专利技术的目的还在于提供一种抑制脑卒中试剂，所述抑制脑卒中试剂包含：(a)抑制剂和/或抑制剂组合物，所述的抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性；(b)药剂学上能接受的载体。优选的，采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。本专利技术的目的还在于提供一种脑卒中诊断试剂，所述脑卒中诊断试剂能够检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。优选的，所述脑卒中诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或基于免疫方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸条检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。更优选的，所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4330和/或miR-4330的引物；所述的基于探针杂交方法包括与mir-4330和/或miR-4330的核酸序列杂交的探针；所述免疫检测方法包括与miR-4330调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。定义：现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。(1)Northern杂交又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。(2)miRNA表达谱芯片原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquidchip)又称多功能悬浮点阵(Multianalytesuspensionarray，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。(3)核酶保护分析技术(RPA)miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但本文档来自技高网...

【技术保护点】
mir‑4330和/或miR‑4330在制备预防、诊断和/或治疗脑卒中试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.mir-4330和/或miR-4330在制备诊断脑卒中试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断脑卒中试剂采用基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录水平的试剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，诊断脑卒中试剂包括采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测脑卒中样本中mir-43...

【专利技术属性】
技术研发人员：何文贞，陈思洽，陈显光，李舜贤，陈文杰，
申请(专利权)人：汕头大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：广东;44