与受体酪氨酸激酶ALK的胞外域结合的抗体制造技术

本发明专利技术涉及对人ＡＬＫ（间变性淋巴瘤激酶）的特异性抗体，特别涉及ｓｃＦｖ、编码ｓｃＦｖ的核酸序列、ｓｃＦｖ的制备方法以及ｓｃＦｖ作为药物或诊断目的的用途。所述抗体适用于肿瘤、特别是成胶质细胞瘤的局部治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人ALK (间变性淋巴瘤激酶)的特异性抗体，特别涉 及scFv、编码scFv的核酸序列、scFv的制备方法以及scFv作为药物 或诊断目的的用途。所述抗体适用于肿瘤或癌症、特别是成胶质细胞 瘤的局部治疗。
技术介绍
ALK (间变性淋巴瘤激酶，CD246)是受体酪氨酸激酶(RTK) 家族中的一员。作为该家族中具有代表性的一员，ALK是一种基本上 由3个结构域构成的I型跨膜蛋白，所述的3个结构域为胞外配体 结合结构域(氨基酸19-1038 )，其包含1个LDL受体A类结构域和 2个MAM结构域(MAM:跨膜肽酶、A5抗体、蛋白质酪氨酸磷酸 酶^);跨膜结构域(氨基酸1039-1059 );以及细胞质结构域(氨基 酸1060-1620)，其包含酪氨酸激酶结构域。信号肽存在于新生蛋白 质的N-末端(氨基酸1-18)，其在分泌时被切断。在1997年，由2个独立的研究组(Iwahara 1997和Morris 1997) 克隆出了人和小鼠的ALK全长序列。ALK与被称为白细胞酪氨酸激 酶(LTK)的RTK高度相似，并且属于胰岛素受体超家族。在ALK 与LTK的重叠区域中，表现出57%的氨基酸一致性，71%的氨基酸相似性(Morris 2001 ) 。 ALK是高度N-糖基化的，并且包含21个公 认的N-糖基化位点。氨基酸687-1034与LTK具有明显的相似性(其 中氨基酸的一致性达到50%)。但是，在N-末端的第686位附近的氨 基酸序列中，除了一段非常短的序列曾在LDL受体中发现以外，其他 序列都没有显示出与任何已知的蛋白质具有同源性(Duyster 2001/SWISSPROT )。此外，ALK在氨基酸264-427和氨基酸478-636 处含有2个MAM结构域(跨膜蛋白、A5抗体、蛋白质酪氨酸磷酸酶 H)。由于这些结构域广泛分布在涉及细胞与细胞间的相互作用中的 多种附着蛋白质中，所以被认为具有附着功能(De Juan 2002)。此 外，在对应于氨基酸396-406处为推定的ALK的配体结合位点(Stoica 2001,参见下文)。鼠ALK的激酶结构域的氨基酸序列与人ALK的 氨基酸具有98。/。的一致性，与小鼠LTK的氨基酸具有78%的一致性， 与小鼠ros具有52%的一致性，与人胰岛素样生长因子受体具有47% 的一致性，与人胰岛素受体具有46%的一致性(Iwahara 1997和 Ladanyi2000 )。到目前为止，还没有关于ALK剪接变体的描述。但 是，ALK通常与染色体的易位有关(参见下文)。ALK基因跨越大约315kb，并具有26个外显子。该基因的大部 分由2大段内含子构成，该内含子跨越大约170kb。 ALK转录本的长 度为6.5kb ( Kutok 2002 )。根据Morris ， ALK的cDNA跨越6226bp(Morris 2001 )。在小鼠胚胎发育过程中的发育阶段的大约Ell天，开始了 ALK 的表达，并且持续到发育的新生儿时期，在新生儿时期，ALK在神经 系统中表达。在成人中，ALK的生理学表达局限于CNS的某些神经 元(神经及神经胶质细胞以及可能的内皮细胞)区域低水平表达(Morris 1997, Duyster 2001， Stoica 2001 )。事实上，ALK的富集 程度在出生后发生降低(Morris 2001 )。基于ALK的表达模式，提 示了在脑发育过程中的受体的作用(Duyster 2001 ) 。 ALK的神经限 制性表达提示，其起到了神经营养因子的受体的作用(参见下文)。 与上文所述的情况相一致，ALK的表达模式与编码神经营养蛋白受体的TRK家族的基因重叠(Morris 2001 )。但是，敲除了 ALK基因的 小鼠没有显示出任何明显的表现型(没有公开的数据)，这可能是由 于与TRK家族的成员或其他神经营养受体具有某些功能上的冗余所 致。明显的是，造血组织显示出无可检测到的ALK的表达(参见下 文)(Morris 2001 )。最近，已经描述了 2种可能的ALK配体"多效生长因子"(PTN) 和"中期因子，，(MK) (Stoica 2001， Duyster2001， Stoica 2002 )。 通过使用纯化的人多效生长因子蛋白来筛选噬菌体展示肽文库来鉴定 了 PTN-ALK间的相互作用。通过这种方法，确定了 ALK存在于胞 外结构域中的序列(氨基酸396-406 )。重要的是，该序列并非与LTK (其为与ALK最密切相关的RTK)共有。此外，在果蝇的ALK的 潜在的同源染色体中，所述的配体结合区域是保守的(Loren 2001 )。 ALK通过与PTN结合而被快速磷酸化(Bowden 2002 )。此外，已经 表明，在细胞培养中使用多效生长因子来刺激ALK。根据多效生长因 子所具有的病理含义，使用该多效生长因子来刺激ALK使得多效生 长因子/ALK间的相互作用特别引人关注(Stoica 2001 )。此外，缺少 ALK表达的细胞系未能显示出对多效生长因子产生生长应答，反之亦 然(Stoica 2001 )。在体内，已经证明在患有各种固体肿瘤的患者血 清中，多效生长因子的含量增高，并且动物研究表明，多效生长因子 有助于肿瘤的生长(Stoica 2001)。在动物模型中，充分地确定了 PTN 作为肿瘤生长中起限速作用的血管生成因子的作用(Choudhuri 1997) 。 1996年，Czubayko等人(Czubayko 1996)证明了 PTN在 肿瘤血管发生以及在防止凋亡和转移(通过采用核酶靶向方法来调节 PTN的含量而实现)中的重要性。小鼠PTN的血清含量测量值证明 了其与肿瘤的大小之间存在着明显的关系。PTN在最恶性的人类癌症种类(例如黑色素瘤和胰腺癌)的某些癌症中具有重要的作用，因此 对ALK抑制剂的其他潜在的应用产生了另人关注的前景(Weber 2000， Stoica 2001 )。在人类患者中，在患有胰腺癌(n = 41， P〈細l) 和结肠癌(n = 65， P = .0079)的患者中，发现血清多效生长因子的水平增高。在健康个体中，在围生期的器官生长过程中以及在成人的神经元和神经胶质的选择性群体中，PTN以严格受调节的方式被表达 出来。如在多种癌症的细胞系中发现的那样，PTN与ALK共表达，这 表明它们可以形成刺激生长的自分泌环(Stoica 2001 )。尽管获得了 全部这些数据，但是文献说明，对于PTN的作用是否只受到ALK的 调节和/或受到其他未确定的PTN受体的调节，仍然还不清楚(Duyster 2001 )。已经提出了至少2种其他可能的PTN受体受体酪氨酸磷酸 酶RPTPp和N-多配体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。但是，RPTPp可能起 到PTN/ALK信号传导的信号传导调节剂的作用，而N-多配体蛋白聚 糖起到了用于配体的分子伴侣的作用(Bowden 2002)。最近，与多效生长因子相关的被称为中期因子(MK)的另一种 分泌型生长因子已经被鉴定出作为用于ALK的第二配体。与PTN相 似，MK的结合和活化功能(例如，在细胞培养中诱导软琼脂上的菌 落形成)能够被抗ALK-ECD的相同的抗体所阻断(St本文档来自技高网...

【技术保护点】
与人ＡＬＫ蛋白质结合的抗体，所述抗体包含可变重链ＣＤＲ３，所述可变重链ＣＤＲ３的序列与ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２所示的序列具有至少５０％的序列一致性，优选具有至少６０％、７０％、７５％、８５％的序列一致性，更优选具有至少９０％的序列一致性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A奥夫德尔毛尔，P李奇特兰，A巴伯利斯，
申请(专利权)人：艾斯巴技术股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]