一种合成具有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键的二聚体块的方法，该方法包括以下步骤： （ａ）将第一个具有５′端保护基和３′端缩合基的核苷衍生物，与第二个具有３′端保护基和５′端羟基的核苷衍生物缩合，形成具有还原的核苷酸间连键的二核苷酸衍生物， （ｂ）用一适当的氧化剂氧化该核苷酸间连键，生成二聚体块烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及寡核苷酸的化学合成。尤其是，本专利技术涉及具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸的合成。自从Zamecnik和Stephenson(Proc.Natl.Acad.Sci.75280-284，1978)发现合成的寡核苷酸能抑制劳氏肉瘤病毒的复制以来，人们对使用寡核苷酸和具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸类似物来控制基因调节和处理病理状况表现出极大兴趣。为了这种目的，已研究出多种方法用于合成寡核苷酸。早期的合成方法包括磷酸二酯和磷酸三酯化学方法。Khorana等(J.Molec.Biol.72209，1972)公开了用于寡核苷酸合成的磷酸二酯化学方法。Reese(Tetrahedron Lett.343143-3179，1978)公开了用于合成寡核苷酸和多核苷酸的磷酸三酯化学方法。这些早期的方法已在很大程度上让位于更有效的亚磷酰胺和H-膦酸酯方法去合成。Beauca-ge和Caruthers(Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)公开了在多核苷酸合成中使用脱氧核苷亚磷酰胺的方法。Agrawal和Zamecn-ik在美国专利No.5149798(1992)中公开了通过H-膦酸酯途径合成寡核苷酸的优化方法。这两个现代方法都已被用来合成具有各式各样经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸。Agrawal和Goodchild(Tetrahedron Lett.283539-3542，1987)讲授了用亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸甲基膦酸酯(oligonucleotide mathylphosponatas)的方法。Connolly等(Biochemistry 233443，1984)公开了用亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸硫代磷酸酯(oligonucleotide phosphorothioates)的方法。Jager等(Biochemistry 277237，1988)公开了通过亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸氨基磷酸酯的方法。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857079-7083，1988)公开了通过H-膦酸酯化学方法合成寡核苷酸氨基磷酸酯(oligonucleotide phosphoramidates)和硫代磷酸酯的方法。亚磷酰胺化学合成法和H-膦酸酯化学合成法都是在存放于反应容器中的固体支持物上进行的。偶联每一个核苷酸必须的反应步骤包括脱三苯甲基、偶联、加帽和氧化。对于小规模合成(达到1μm摩尔)来说，增加一个核苷酸所需总时间约为6分钟。装配一个30个链节长的寡核苷酸可在180分钟内完成。在这些条件下，合成的寡核苷酸具有化学纯度和生物学活性。然而，当寡核苷酸以较大规模合成(达到1毫摩尔)时，在CPG上增加每一个核苷酸的时间约为50-60分钟，装配一个具有25个链节的寡核苷酸大约需要25小时。时间的增加是由于合成中使用的固体支持物的体积所致。周期时间的增加使已经被装配的寡核苷酸序列暴露于所有反应步骤(包括二氯乙酸步骤、偶联步骤、氧化步骤和加帽步骤)较长的时间。装配总时间的增加不仅影响该化合物的化学性质和生物学性质，也影响其产率。化学性质和生物学性质主要受脱嘌呤作用、碱基修饰等的影响。为减少这些问题的影响，可以用二聚体或多聚体合成子(Syn-thon)合成寡核苷酸，从而减少周期数，并由此减少合成寡核苷酸所需时间。为达到这一目的，几位研究者都曾为开发出可接受的二聚体或多聚体合成子方法做出了努力。Khorana(Science 203614-625，1979)用磷酸二酯方法，提出了多聚体合成子的概念。Crea和Itakura(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.755765-5769，1978)；Reese(Tetrahedron Lett.343143-3179，1978)；和Ohtsuka等(NucleicAcids Res.106553-6570，1982)都公开了在磷酸三酯方法中使用二聚体或三聚体合成子的方法。Kumar和Poonian(J.Org.Chem.494905-4912，1984)和Wolter等(Nucleosides and Nucleotides 565-77，1986)公开了用二聚体合成子合成寡核苷酸磷酸二酯的亚磷酰胺方法。Marugg等(Nucleic Acids Res.129095-9110，1984)讲述了用二核苷酸硫代磷酸三酯制备含有一个硫代磷酸酯连键的寡核苷酸的方法。Connolly等(Biochemistry 233443，1984)；和Coss-tick和Eckstein(Biochemistry 243630，1985)公开了用亚磷酰胺方法在正在增长的寡核苷酸链上增加一个二核苷酸硫代磷酸酯的方法。Brill和Caruthers(Tetrahedron Lett.283205，1987)公开了合成胸腺嘧啶二核苷酸甲基硫代膦酸酯的方法。Roelen等(NucleicAcids Res.167633-7645，1988)公开了液相反应中用二聚体核苷酸甲基硫代膦酸酯TA在一短的六聚体寡核苷酸中引入单个甲基硫代膦酸酯连键的方法。上述的研究工作代表了用二聚体或多聚体合成子合成寡核苷酸方法的进展。遗憾的是仍存在一些不足。例如，现有的制备包含有硫代磷酸酯或甲基硫代膦酸酯核苷酸间连键的二聚体核苷酸的化学方法非常复杂。因而，至今已报道的仅有两例含有甲基硫代膦酸酯的二聚体(TT和TA)。而且，没有一个现有的二聚体合成子被成功地用于合成唯一由烷基膦酸酯，氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键的寡核苷酸。因而，人们需要一种用简化的化学方法合成二聚体合成子的新方法，也需要一种用这样的二聚体合成子装配寡核苷酸的新方法。本专利技术提供了制备二聚体核苷酸合成子(下文简称二聚体块(dimer block))的新方法，该二聚体块具有经修饰的核苷酸间连键，并最好为烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键。根据本专利技术这一方面的内容，不管二聚体块中核苷酸间连键为何类型，二聚体块的合成是以单罐液相反应进行的例如，为合成二聚体块烷基膦酸酯，将核苷3′-烷基亚磷酰胺与3′保护的核苷缩合。为合成二聚体块氨基磷酸酯，核苷酸之间H-膦酸酯缩合后加入烷基胺。为合成二聚体块硫代磷酸酯，被保护的单体核苷酸液相偶联，进行核苷酸缩合，产生二聚体后，用一适当硫化剂进行硫化作用。为制备二聚体块烷基硫代膦酸酯，在与所述二聚体块硫代磷酸酯相同的单罐反应中使用烷基亚膦酰胺。这一简单的化学方法首次允许合成所有可能的二聚体块甲基硫代膦酸酯，其中，先前已知的仅有TT和TA，并有助于制备具有3′缩合基的二聚体块。这样，本专利技术的第二方面提供了新型的二聚体块，该二聚体块包括含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯连键的GG、GA、GT、GC、AG、AA、AT、AC、TG、TA、TC、TT、CG、CA、CT或CC，并具有各种保护基和缩合基组合。这些新的二聚体块也导致了用这些二聚体块装配含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯连键的寡核苷酸的方法出现。并且，根据本专利技术的二聚体块首次提供了一种用这些二聚体块装配只含有烷本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤锦炎，帕特里夏·L·亚达罗拉，休德海尔·阿格里沃尔，
申请(专利权)人：海布里顿公司，
类型：发明
国别省市：
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