本发明专利技术涉及用于制备ｓｉＲＮＡ的氟代寡核苷酸（ＦＡＮＡ）的合成，其特征在于以１－乙酰基２，３，５－三Ｏ－苯甲酰基－β－Ｄ－呋喃核糖为原料，经氟代和溴化反应得到１－溴－２－脱氧－２氟－３，５－二－Ｏ－苯甲酰－α－Ｄ－阿拉伯糖，用碱基或特定修饰的碱基与１－溴－２－脱氧２－氟－３，５－二－Ｏ－苯甲酰－α－Ｄ－阿拉伯糖通过亲核取代（ＳＮ２）反应，再水解制备得到系列２′－ＦＡＮＡ类核苷酸衍生物。该合成工艺路线具有原料易得和产率较高的特点，利用２′－ＦＡＮＡ类核苷酸，可以用于制备系列ｓｉＲＮＡ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物有机合成
，涉及用于制备siRNA的氟代寡核 苷酸(FANA)的生物有机合成方法。
技术介绍
肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。它的形成是由多基因突变累积与相互作用形成导致的。从1998年发展起来的RNA干扰技术，是由siRNA介导的高度特异的转录后基因沉默效应，具有高效性，特异性的特点(Andrew Fire， et al. Nature, 1998,391:806-811)。现己发展成为一种成熟的抑制靶基因表达的有力工具，尤其是对于由基因转录水平增加而导致的基因过度表达是一种强有力的抑制手段(Xia Haibin， et al.Nature, 2002， 20:1006-1010)。 RNA千扰应用于肿瘤治疗目前主要的障碍是转运途径的问题，目前解决这个问题的最有效的途径有两个1、化学修饰siRNA，使其具备更好的核糖核酸酶抗性，从而提高其生物稳定性，增加其生物利用度；2、应用病毒载体表达shRNA，从而使被感染细胞内能够较为容易的表达shRNA。其它的如脂质体等转染试剂帮助siRNA或shRNA表达载体转运也是很有希望的途径(Arndt B. Cancer cell,2002, 2(3): 167-168)。 siRNA在体内环境的生物稳定性很差。实验表明，没有经过修饰的siRNA在血清中的半衰期小于15分钟，这极大的限制了 si脂A在临床治疗中的应用。为解决该项技术的缺陷，目前研究已经证实，经过化学修饰后的siRNA能在保留原有生物活性的基础之上，进一歩提高体内的稳定性，其在血清中的半衰期可以增加数十倍，具备了临床治疗应用的潜力(ElbashirSM, et al.Nature. 2001; 411: 494-498)。文献报道的化学修饰副A方法较多，主要分为核糖核酸的末端和化学基团修饰、核苷酸的骨架修饰或2' -、 4'-位修饰、碱基修饰、组合修饰等等。硫代磷酸的修饰是第一代的核酸修饰方法，其产物抗核酸酶解能力较强，但是有较大的非特异毒性。核糖的2位羟基的烷基修饰是第二代的核酸修饰法，其重要代表是2' -0-methyl (OMe)和2， -0-methoxy-ethyl (MOE) RNA。其产物在性能上虽有一定改善，但非特异毒性依然存在。在这个基础上，发展了许多各式各样的修饰方法，主要有P印tide nucleic acids(PNAs)、 N3， -P5， phosphoroamidates (NPs)、 ' -Deoxy-2， -fluaro-b-D-arabino nucleic acid (FANA)、 Locked nucleic acid (LNA)、 Morpholinooligonucleotides (MF)、 Cyclohexene nucleic acids (CeNA)、 Tricyclo-DNA (tcDNA)等方法，称之为第三代的核酸修饰法(Xiaolan Chen, et al .Drug discovery todaytargets, 2005,10 (8): 587-593)。FANA(2' -Deoxy-2， -fluoro-b-D-arabino nucleic acid， 2'-脱氧-2，-氟-b-D-阿拉伯糖核苷酸)修饰的RNA是指由FANA替代核糖组成寡核苷酸的骨架形成的RNA类似物。近几年的文献已证实，FANA修饰是极少数的能够增强siRNA血清中半衰期的同时还能增强siRNA的活性的方法之一 (Chiu YL , et al . RNA, 2003， 9 (9) : 1034 1048)。但目前尚未见到该方法修饰的siRNA应用于肿瘤治疗的报道。采用FANA修饰法对siRNA进行恰当的修饰，既能保留甚至增强其生物学活性，又能显著增加其生物学稳定性，是一种很有前景的siRNA修饰方案。本专利技术提供了。
技术实现思路
本专利技术通过下述方法实现的本专利技术涉及用于制备si脂A的氟代寡核苷酸(FANA)的合成方法如下① 以1-乙酰基-2， 3， 5-三-0-苯甲酰基-{3-D-呋喃核糖为原料，二氯甲烷为溶剂，在酸性条件下，经重排反应，制备获得，以l， 3， 5-三-0-苯甲酰基-2-羟基-13-D-呋喃核糖，收率约70%。② 经三氟甲基磺酸酯取代活化，通过亲核取代(SN2)反应，利用氟化试剂进行氟代反应，获得关键中间体2-脱氧-2-氟-1， 3， 5-三-0-苯甲酰-e-D-阿拉伯糖。③ 在氢溴酸乙酸的条件下，溴代反应制备1-溴-2-脱氧-2-氟-3， 5-二-0-苯甲酰-e-D-阿拉伯糖。 采用修饰好的碱基或未经修饰的碱基与1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二-0-苯甲酰-e-D-阿拉伯糖进行氮垸基取代反应，通过水解制备获得系列FANA核苷酸单体。具体实施例方式下面结合具体的实施例'对本专利技术作进一歩的阐述，但不限于这些具体的实施例，两所有的实施例均按上述的操作歩骤操作。(1) 〗，3， 5-三-0-苯甲酰基-2--羟基-f)-呋喃核糖的制备将20g的卜乙酰基 2， 3， 5-三-0-苯甲酰基--e-!)-呋喃核糖(40卿o1)溶于二氯甲烷8(ki，加入乙酰氯3rai， 0-5"通入千燥氯化氢搅拌2 h，冰箱静賈i2h。减压浓缩至干，剩余油状物溶于乙腈30ml，滴加水5m]，冰水浴条件下搅拌，0匸放置2h后，抽滤，滤饼用冰乙醚20rol洗涤，干燥，得到的白色固体16g，溶于乙酸乙酯iOOnd，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩至干，得白色固体i2 g，卿140-142°C。W,R (DMS()， 400,z) : 6 7,4-8. 1 (m， 15H), 6.3 (s,lH), 5.8(m, 1H)， 5.7(d,4, 8(m, iH), 4. 6-4. 7 (dd, 1H), 4. 4-'4. 5 (dd, 1H)(2) i， 3， 5-三-0~苯甲酰基-2-氟H-呋喃核糖的制备将12 g的1， 3， 5-三-0-苯甲酰基-2-羟基-D-呋喃核糖溶于二氯甲垸200ml中，-2(TC滴加7 g硫酰氯，(HTC加入10m]的D,，反应3 h，分批加入咪咪^g，搅拌4 h 。反应液倾入冰水中，i00ml的二氯甲垸提取3次，合并有机相'饱和盐水洗2次'无水硫酸镁千燥，过滤，滤液蒸除溶剂，剩余油状物加至异丙醇25ml中，加入石油醚50ml，静置析晶，滤饼用异丙醇与石油醚混合液洗涤'烘千，得白色粉末状固体iO. 5g， mpl29-13rC。将10. 5g的1， 3， 5-三-0-苯甲酰基-2-咪唑磺酰基-D-呋喃核糖溶于100ml的乙酸乙酯，加入13. 5g的37%的氢氟酸三乙胺溶液，8(TC搅拌3 h， TLC显示原料全部转化完全，加入10ml三乙胺，继续反应3h。停止加热，自然冷却至室温，反应液倒入冰水(200ml )中，加入碳酸氢钠调至中性，乙酸乙酯40m]ml提取3次，合并有机相，饱和盐水洗涤2次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓縮，得7.2g油状物，加入乙醇与水的混合液中重结品，得3.7g的白色固体物。(注油状物也可以直接投入下歩反应)。'HNMR (DMSO' 400MHz) : S 7.4-8.本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术涉及用于制备ｓｉＲＮＡ的氟代寡核苷酸（ＦＡＮＡ）的合成，其特征在于以１－乙酰基－２，３，５－三－Ｏ－苯甲酰基－β－Ｄ－呋喃核糖为原料，经氟代和溴化反应合成１－溴－２－脱氧－２－氟－３，５－二－Ｏ－苯甲酰－α－Ｄ－阿拉伯糖，用碱基或特定修饰的碱基与１－溴－２－脱氧－２－氟－３，５－二－Ｏ－苯甲酰－α－Ｄ－阿拉伯糖通过亲核取代（ＳＮ２）反应，再水解制备得到系列２′－ＦＡＮＡ类核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉成，胡晓，王理想，王友志，胡玲，周飞，丁庆燚，胡曼曼，瞿志荣，赵红，胡曼曼，王圣良，杨海，方传玲，胡丹红，徐曼，
申请(专利权)人：徐州瑞赛科技实业有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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