具有改良抗流感活性的经修饰寡核苷酸制造技术

一种经修饰的抗流感寡核苷酸，含有与流感病毒必需核酸序列互补的核苷酸序列，其中，该寡核苷酸是含有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域以及烷基膦酸酯区域的混合骨架的嵌合寡核苷酸。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是1992年7月2日提交的编号为07/909,069的部分继续申请，也是1992年7月23日提交的编号为07/918,239的部分继续申请，也是1991年5月10日提交的编号为07/69 8,568的部分继续申请。本专利技术涉及反义寡核苷酸，本专利技术尤其涉及可抑制流感病毒复制或增殖的经修饰的寡核苷酸。甲型流感病毒是膜包裹病毒，其基因组是成段的负链RNA。在A株(Strain)和B株的八个单链RNA片段、在C株的七个单链RNA片段上存在十个流感病毒基因。片段的大小不同(长度在890至2341个核苷酸之间)，每一个都是不同mRNA合成的模板。流感病毒的病毒粒子含有自这些模板合成mRNA所必需的病毒特异性RNA聚合酶，当这种特异性聚合酶缺乏时，流感病毒RNA负链不具感染力。当流感病毒mRNA聚合酶从细胞mRNA或mRNA前体的5＇末端取走12至15个核苷酸并使用该外来寡核苷酸作为引物时，就会发生mRNA转录的起始。通常，通过此过程得到的mRNA只编码一种蛋白质。M RNA和NS RNA也编码剪接过的mRNA，这可导致这两个片段的每一个都产生两种不同的蛋白质。流感病毒感染人和动物(例如猪、鸟、马)，可导致急性呼吸道疾病。已有大量尝试想制出能有效抵抗流感病毒的疫苗。然而没有一个完全成功，尤其是在长期这个基础上。这至少部分是由于流感病毒基因组成片段的特征，使得通过片段的重排，以众多形式存在成为可能。例如，已提出动物和人流感病毒之间RNA片段可相互交换以导致将新的抗原亚型引入两个种群中。因此由于新亚型(抗原“转变”)的出现使得长期接种法失败。另外，病毒的表面蛋白质，血凝素和神经氨酸苷酶经常有细微的抗原变化(抗原“漂变”)。这一高度变化性解释了对特异流感病毒产生的特异免疫力不能建立对新变异体的防护的原因。因此，需要另外的抗病毒策略。尽管乙型和丙型流感病毒与甲型流感病毒相比较少引起临床疾病，化学抗病毒药也应有助于控制这些病毒引起的感染。因此，人们很有兴趣开发能够抑制流感病毒复制或增殖的反义寡核苷酸。这种反义寡核苷酸有希望提供较宽的抗不同流感病毒株的保护，因为它们可被设计为能与多种流感病毒株上存在的流感病毒基因组的保守区域杂交。Agrawal等人在美国专利5,194,428中的内容列入本文作为参考，它公开了具有某种经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸，通过与流感病毒PB1聚合酶基因杂交可抑制流感病毒的复制。Cowsert等人在WO92/03454(1992)中公开了通过用反义寡核苷酸、与流感病毒聚合酶1、2或3、或血凝素、核蛋白、神经氨酸苷酶、基质蛋白或非结构蛋白质基因杂交，或者与不同的剪接连接位点或包装序列杂交，可抑制流感病毒增殖。Pederson等人在美国专利5,149,797和5,XXX,XXX(编号为07/839,472，于1992年12月24日被准许)中的内容列入本文作为参考，它公开了嵌合混合的磷酸酯骨架的寡核苷酸，此寡核苷酸具有与RNase H失活片段(inactivating segment)相邻的RNase H激活片段。因此，反义寡核苷酸有希望成为抗流感的治疗剂。然而，同其它任何这类药剂一样，仍需要改善它以使其抑制流感病毒复制或增殖的效力更高。这种经改良的反义寡核苷酸有助于研究流感病毒基因组中的哪个区域是具有宽的跨品系抑制性，和作为抗流感治疗剂应用的最佳候选者。本专利技术提供了经修饰的寡核苷酸，它与先前已知的寡核苷酸相比，具有较高的抑制流感病毒复制或增殖的效力。这些经修饰的寡核苷酸的特征在于具有与来源于流感病毒的必需核酸充足互补的核苷酸序列，以使之能与细胞中这种流感病毒的核酸杂交。在优选的实施方案中，这种必需核酸是流感病毒PB1、2或3聚合酶基因或血凝素、核蛋白、神经氨酸苷酶、基质蛋白或非结构蛋白质基因的一部分，或者是不同的流感病毒剪接连接位点或包装序列的一部分。在不同的实施方案中，根据本专利技术的经修饰的寡核苷酸具有一种或多种类型的经修饰的核苷酸间连键。在优选的实施方案中，至少一些经修饰的核苷酸间连键是硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键。在一些优选的实施方案中，硫代磷酸酯核苷酸间连键存在于经修饰的寡核苷酸中，后者还含有其它修饰，即非磷酸二酯键。优选地，这些其它经修饰的核苷酸间连键是烷基膦酸酯键或烷基硫代膦酸酯键。最优选地，这些其它经修饰的核苷酸间连键存在于寡核苷酸的一端或两端或者在其附近。在另外的根据本专利技术的经修饰寡核苷酸的优选实施方案中，硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键存在于具有一个或多个经修饰核苷的寡核苷酸中。优选地，这种经修饰的核苷是2＇-O烷基核苷。最优选地，至少一些经修饰的核苷位于寡核苷酸的一端或两端或者在其附近。在另外的根据本专利技术的经修饰寡核苷酸的优选实施方案中，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间连键存在于一端或两端具有帽结构因而被赋予核酸外切酶抗性的寡核苷酸中。优选地，这种帽结构至少位于分子的3＇末端。这种帽结构也可存在于根据本专利技术的经修饰寡核苷酸所有实例的一端或两端，优选至少存在于寡核苷酸的3＇末端。在另一个根据本专利技术的经修饰寡核苷酸的优选实施方案中，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间连键存在于一寡核苷酸中，此寡核苷酸通过位于一端或两端或其附近的，优选至少为3＇末端或其附近的、涉及自身互补区域的核苷酸，来达到自身的稳定。该寡核苷酸因而形成了发夹样结构。这些根据本专利技术的经修饰的寡核苷酸中的每一种与和相同基因杂交的任何已知的寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸相比，具有更强的抑制流感病毒复制或增殖的效力。这些根据本专利技术的经修饰的寡核苷酸中的每一种也可任选地含有其它对寡核苷酸的糖或碱基的修饰，也可任选地具有除硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯键以外的其它核苷酸间连键。图的简要描述附图说明图1所示为流感病毒PB1(聚合酶1)基因的核苷酸序列，由此可制得互补的反义寡核苷酸。图2所示为根据本专利技术的自身稳定化抗流感的经修饰寡核苷酸。图3所示为根据本专利技术的自身稳定化抗流感的经修饰寡核苷酸的可替换形式。图4所示为可赋予寡核苷酸核酸外切酶抗性的一些优选的帽结构。图5所示为5＇端加帽、3＇端加帽、未加帽的寡核苷酸的体内降解模式。图6所示为自身稳定化和非自身稳定化寡脱氧核苷酸磷酸二酯的DNA聚合酶I的3＇-核酸外切酶降解模式。图7所示为自身稳定化和非自身稳定化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯的RNA聚合酶I的3＇-核酸外切酶降解模式。优选实施方案的详细描述本专利技术涉及具有抗流感活性的反义寡核苷酸。本文的活体内具有抗流感活性的经修饰寡核苷酸被称为经修饰抗流感寡核苷酸。本专利技术所提供的经修饰抗流感寡核苷酸与已知的与相同基因杂交的寡核苷酸或经修饰寡核苷酸相比，所具有的抑制流感病毒复制或增殖的效力更强。根据本专利技术的经修饰寡核苷酸所具有的特别优选的特征将在以下的每个优选实施方案中更详细地讨论。除了这些特征以外，根据本专利技术的经修饰寡核苷酸可任选地具有附加的核糖核苷酸、2-取代的核糖核苷酸、和/或脱氧核糖核苷酸单体，它们中的任何一个都通过包括本领域中已知的任何核苷酸间连键的5＇至3＇连键连接在一起。优选地，这种经修饰寡核苷酸可任选地含有磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基醚、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：休德海尔·阿格沃尔，唐金彦，艾贝星格·帕德玛里亚，
申请(专利权)人：海布里顿公司，
类型：发明
国别省市：