寡核苷酸烷基膦酸酯和烷基硫代膦酸酯制造技术

一种寡核苷酸类似物，含有至少一个核糖核苷酸烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于反义方法的合成寡核苷酸。尤其是，本专利技术涉及具有修饰的糖磷酯骨架的合成寡核苷酸(这种修饰可增强其反义特性)以及它们的应用。各种生物分子对细胞核酸靶位的序列特异性识别和结合是分子生物学过程的(如基因表达与调控)基础。根据序列特异的核酸靶位设计多肽用于包括治疗目的的许多应用是很困难的，因为至今关于蛋白质与DNA之间的序列特异性的识别与互相作用还知之甚少。然而，可以设计和开发序列特异性的寡核苷酸，通过与DNA上的任一预先确定的序列形成三螺旋而结合，和通过与RNA上的预定序列形成双螺旋而结合，因为碱基通过氢键的相互作用而互补识别。根据这一理论，在分子及细胞生物学中现已广泛地应用天然的和修饰的寡核苷酸来研究生物体内某些特殊基因所起的作用。最近几年，在细胞培养系统中，已应用寡核苷酸与mRNA的相互作用来阻断特定基因的表达(Uhlmann等(1990)Chem.Rev.90543-584；Helene等(1990)Biochem.Biophys.Acta 104999-125)。这些反义寡核苷酸可在体内用作治疗剂。例如，可应用反义寡核苷酸来抑制大鼠颈动脉的平滑肌细胞的迁移或生长(Simons等(1992)Nature 35967-70)。作为有用的治疗剂，反义寡核苷酸必须能被细胞吸收，并在此发挥作用。天然的磷酸二酯键相连的寡核苷酸由于其多阴离子性质不能有效地被细胞吸收。在细胞内它们也易于被核酸酶水解(见Wickstrom(1986)Biochem.Biophys.meth.1397-102)，这样限制了它们在体内的应用。为了提高细胞的吸收及对核酸酶作用的抵抗，对这些寡核苷酸的糖磷酯骨架进行了修饰。如Ts′O等(美国专利No.4469863)和Miller等(Biochem.(1981)201874-1880)制备了含有甲基膦酸酯连键的寡脱氧核苷酸。其它修饰包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和磷酸酯(phosphate ester)。现已合成了嵌合性的寡脱氧核糖核苷酸，它具有一种以上类型的核苷酸间连键，如上面描述的这几种修饰的连键。如Pederson等(美国专利NO.5149797，本文在此引入作为参考)公布了嵌合性寡核苷酸，它们有寡核苷酸磷酸二酯或者寡核苷酸硫代磷酸酯核心序列，该核心序列两侧有寡核苷酸甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。Furdon等(Nucleic Acids Res.(1989)179193-9204)公布了嵌合性寡脱氧核糖核苷酸，这些寡核苷酸除了有寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸酯或甲基膦酸酯外，还有寡核苷酸磷酸二酯区。Quartin等(NacleicAcids Res.(1989)17(7523-7562)公布了具有寡核苷酸磷酸二酯和寡核苷酸甲基膦酸酯区的嵌合性寡脱氧核糖核苷酸。许多这些修饰的寡核苷酸已提高了反义寡核苷酸的治疗效果。然而仍然存在某些不足，这些不足限制了寡核苷酸作为治疗剂的作用。如Agrawal等(proc.Natl.Acad.Sci.(USA)871401-1405)讲述了当寡脱氧核糖核苷酸氨基磷酸酯与RNA杂交时，不能激活RNA酶H，而该酶的激活对于反义寡核苷酸的功能来说是很重要的。Agra-wal等(Nucleosides & Nucleotides(1989)85-6)也讲述了当寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸酯与RNA杂交后，降低了双螺旋的稳定性。因此，还有必要改进寡核苷酸来克服现有技术已知的寡核苷酸的缺陷。最理想的是，这样的寡核苷酸应该抵抗核酸酶的降解并能与RNA形成稳定的双螺旋体。首先，本专利技术提供了具有非离子型核苷酸间连键的合成寡核苷酸类似物。该寡核苷酸类似物具有高度的核酸酶抗性，可与RNA形成十分稳定的双螺旋体，并具有必需的亲水性而容易被细胞吸收。这些类似物的必备条件就是在寡核苷酸内和/或在其一端或两端的任意选定位置上，他们至少有一个核糖核苷酸烷基膦酸酯或者烷基硫代膦酸酯。在本专利技术中，“寡核苷酸”一词包括一个或多个核糖核苷酸单体至少通过一种5′到3′核苷酸之间的连键连接在一起的、或者连接到一个脱氧核糖核苷酸单体的多聚体。这种连键包括在反义寡核苷酸现有技术中已知的任何一种连键。此外，“寡核苷酸”一词也包括具有核酸/碱基和/或糖基修饰的分子，加入了如二胺、胆甾烯基和其它脂溶性基团取代基的分子，和2′位取代的核糖核苷单体。“寡核苷酸类似物”一词包括至少有一个非磷酸二酯核苷酸间连键和/或具有修饰的核酸/碱基和/或糖基的寡核苷酸。在优选实施方案中，根据本专利技术的寡核苷酸类似物的长度范围为约2-约60个核苷酸，最优选的长度在约25-约30个核苷酸。因此，根据本专利技术的寡核苷酸将有1～约59个核糖核苷酸烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯，或者这两种连键的组合，并最好具有大约24到29个基团。如本文所用，烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯是一含有膦酸酯或硫代膦酸酯连键的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或2′-取代的核糖核苷酸，并在2′位有一烷基，包括(但不限于)甲基，乙基，丙基，或丁基。在本专利技术的一些实施方案中，该寡核苷酸类似物在其分子内的某些位置含有烷基膦酸酯和/或烷基硫代膦酸酯，而在其它位置含有通过磷酸二酯键或通过人造连键连接的天然核苷酸。这些称之为嵌合性或杂合性寡核苷酸。如本文所用，人造核苷酸间连键是一种非磷酸二酯连键，它把核糖核苷酸单体从5′到3′连接在一起，它包括(但不局限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、碳酸酯、磷酸酯(phosphate ester)、氨基磷酸酯和氨基甲酸酯。在本专利技术的另一实施方案中，该寡核苷酸类似物至少含有一个，最好是6-10个，2′-取代的核糖核苷酸。在本专利技术中，“2′-取代的”含意为用，如2′-O-甲基、2′-烯丙基、2′-芳基、2′-烷基、2′-卤基、或2′-氨基，但不用2′-H取代戊糖分子中的2′-OH，其中，烯丙基、芳基、或烷基可以用卤基、羟基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、三氟甲基、烷酯基、氨基不取代或取代。第二，本专利技术提供了用于治疗的药物配方，它对于治疗病毒感染、病原性微生物感染、或由于因异常基因表达或异常基因产物的表达而导致的疾病是很有效的。这类治疗的药物配方包括根据本专利技术第一部分的、生理上可接受载体携带的寡核苷酸。第三，本专利技术提供了应用上面已描叙的寡核苷酸类似物抑制病毒基因、病原微生物基因、或细胞基因表达的一种方法。该方法包括用本专利技术的寡核苷酸类似物处理在前两种情况下病毒或病原性微生物感染的细胞，或一般来说后一种情况下的细胞。第四，本专利技术提供了一种治疗哺乳动物所患的某些疾病或异常的方法，这些疾病或异常是由于病毒或病原微生物感染，或是由于某一细胞基因的异常表达或异常产物引起的。该方法包括给哺乳动物施用含有根据本专利技术的寡核苷酸类似物的治疗用药物配方，其施用量足以使其与病毒、病原体、或基因的核酸形成稳定的双螺旋体因此使之失去活性。优选的用药途径包括口服、鼻内施用、直肠施用、静脉注射及局部施用。这一治疗方法也可包括其它治疗剂与含有寡核苷酸类似物的配方的联合施用。结合附图阅读下面的描叙，可更全面地理解本专利技术上文叙述的内容和其它内容，及专利技术本身。附图说明图1是表示各种磷酸酯骨架连键和修饰的示意图图1A，磷酸二酯；图1B，甲基硫代本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：埃卡姆巴·R·坎德马拉，贾马尔·坦姆萨妮，萨德海尔·阿格雷沃尔，
申请(专利权)人：海布里顿公司，
类型：发明
国别省市：