磺酰化改性甘露寡糖及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种通过对魔芋甘露寡糖的自由羟基磺酰化化学修饰得到的磺酰化改性甘露寡糖Ｒ＃－［１］－（Ｒ＃－［ｘ］）＃－［ｎ］－Ｒ＃－［２］，其中，ｎ为０或１－３之间的整数，Ｒ＃－［１］和Ｒ＃－［２］以及每一个Ｒ＃－［ｘ］代表一个单糖单元，相邻的单糖单元由β－１，４糖苷键连接，右边为还原端，甘露寡糖的自由羟基的磺化度为１０－３０％。本发明专利技术还公开了该磺酰化改性甘露寡糖的制备方法，包括将魔芋多糖溶液用嗜碱芽孢杆菌的β－甘露聚糖酶经水解反应得到甘露寡糖干粉；用磺酸化试剂进行磺酰化修饰，得到磺化度为１０％～３０％的磺酰化甘露寡糖。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，特别涉及一种通过以酶水解魔芋多糖获得魔芋甘露寡糖并对魔芋甘露寡糖的自由羟基磺酰化化学修饰而得到的磺酰化改性寡糖以及该磺酰化改性寡糖的制备方法。早在50年代就已发现富含阴离子的多聚物有抑制疱疹病毒复制的作用(参见Witvrouw M，De Clercq E Gen Pharmacol 29.4(1997)497-511)，此后天然的富含磺酸基团的多糖，如肝素(参见BagasraO，Whittle P，etal J Infect Dis 164.6(1991)1082-90)等，都被发现有抗病毒活性，尤其是在防治HIV病毒方面。而在应用天然磺酰化多糖开发抗病毒药物的同时，也开始了对中性多糖的磺酰化修饰制备抗病毒活性物质的研究，目前已有成功报道的包括右旋糖苷(参见Bagasra O，Whittle P，et al J Infect Dis 164.6(1991)1082-90)，牛膝多糖(参见药学学报30.2(1995)107-111.，田庚元，李寿桐等)，阿洛多糖(Allopyranan)(参见KazuyukiHatori，Takashi Yoshida et al，Carbohydrate Research 312(1998)1-8.)，甘露聚糖(5.Wells KH，Poiesz BJ J Am Acad Dermatol 1990 Jun；22(6Pt2)1175-95)等。对于其作用机理，目前认为是利用其丰富的负电荷掩蔽HIV病毒包膜上的糖蛋白gp120的V3 loop区的正电荷，从而阻碍了病毒对靶细胞(如CD4+细胞)表面的硫酸乙酰肝素(heparan sulfonate)的接近和粘附，阻碍了病毒对靶细胞受体的识别结合，从而抑制了病毒的侵染(参见Bagasra O，Whittle P，etal J Infect Dis 164.6(1991)1082-90)。但是无论是天然的还是合成的，这些磺酰化多糖都因为分子量大，使其在体内有难于吸收，高的抗原活性和高抗凝血活性等缺点，从而使其实际应用受到了限制，而低分子量的磺酰化寡糖和磺酰化单糖可以克服这些缺点。目前，利用水解多糖和直接磺酰化修饰寡糖(参见Shoji et al，US Patent US5280111 Jan 18，1994)及单糖也得到了多种抗病毒活性物质，例如肝素片段(参见Rider CCGlycoconj J 1997 Aug；14(5)639-42)，海带寡糖(参见KanameKatsuraya，et al，Carbohydrate Research 260(1994)51-61.)和6-磺酸基葡萄糖胺(参见Bagasra O，Whittle P，et al J InfectDis 164.6(1991)1082-90)，可以看出，磺酰化寡糖必将是抗病毒药物前体的一个重要来源。同时，在目前所知的抗HIV的药物中，化学抑制剂仅AZT(叠氮胸腺嘧啶)得到了实际的应用，但是AZT对人体有着极大的副作用，而磺酰化寡糖属天然结构类似物，对人体的副作用要小的多，所以在开发新的抗病毒药物方面有着广阔的前景。甘露寡糖是一种由2到10个葡萄糖和甘露糖通过β-1，4糖苷键连接形成的非吸收性寡糖。目前，这类非吸收性寡糖作为一种功能性食品，越来越多地引起人们的重视。作为一种功能性食品，其可有效地促进双歧杆菌生长，稳定肠道微生态环境，提高人体免疫力，调节人体代谢吸收(参见Roberfroid MB Adv Exp Med Biol1997；427211-9)。但目前对于非吸收性寡糖的应用研究更多的还是用来防治胃肠道疾病，而对于防治肿瘤及诸如爱滋等病毒传染病这些人类健康的大敌方面的应用还很少。同时，目前尚未见到有关于生物法制备磺酰化改性的甘露寡糖的报道。专利技术目的本专利技术的一个目的是提供一种具有抗病毒和抗肿瘤活性并且毒性低的磺酰化改性甘露寡糖。本专利技术的另一个目的是提供一种制备如上所述的磺酰化改性甘露寡糖方法。按照本专利技术的磺酰化改性甘露寡糖，其中所述的单糖单元为葡萄糖或甘露糖。按照本专利技术的磺酰化改性甘露寡糖，其中所述的甘露寡糖的自由羟基的磺化度为15-20％。按照本专利技术的磺酰化改性甘露寡糖，其中所述的甘露寡糖是利用嗜碱芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉而制备的。按照本专利技术的第二个方面，本专利技术提供了如上所述的磺酰化改性甘露寡糖的制备方法，该方法包括如下步骤(1)将魔芋多糖溶于氢氧化钠溶液中，用盐酸溶液将其中和至PH值为7后，在蒸馏水中透析24小时，然后用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液稀释得到浓度为0.5％的魔芋多糖溶液；(2)将嗜碱芽孢杆菌的碱性β-甘露聚糖酶溶液加入到上述步骤(1)得到的魔芋多糖溶液中，在50-70℃保温6-30小时，然后加热煮沸5分钟停止水解反应，得到聚合度为2-6的甘露寡糖，经分离纯化和减压干燥得到甘露寡糖干粉；(3)采用干吡啶作为溶剂，加入上述得到的甘露寡糖干粉和1～4倍当量于所述的甘露寡糖中的总自由羟基的磺酸化试剂，剧烈搅拌下，在0～100℃的水浴中反应0.5～48小时完成磺酰化修饰，得到磺化度为10％～30％的磺酰化甘露寡糖。按照本专利技术方法，进一步包括下述的分离纯化步骤(4)加入活性炭煮沸3～5分钟，除去其中的色素；(5)加入饱和Ba(OH)2溶液调节pH到7.0～7.5以除去其中的硫酸根离子；(6)用甲醇多次重结晶以分离其中的氯离子得到纯化的磺酰化甘露寡糖；(7)将纯化的磺酰化寡糖在低于60℃的温度下减压浓缩后用4～6体积的甲醇沉淀，最后用乙醚洗涤，烘干即得到磺酰化甘露寡糖。专利技术的详细描述以下对本专利技术进行详细描述。本专利技术的专利技术人通过对魔芋甘露寡糖的自由羟基进行磺酰化化学修饰而得到了一种磺酰化改性甘露寡糖，其中的甘露寡糖的结构通式如下R1-(Rx)n-R2其中，n为0或1-3之间的整数，R1和R2以及每一个Rx代表一个单糖单元，相邻的单糖单元由β-1，4糖苷键连接，右边为还原端，甘露寡糖的自由羟基的磺化度为10-30％。本专利技术的磺酰化改性甘露寡糖中，其中的寡糖为甘露糖和葡萄糖，并且主要是二糖、三糖、四糖、五糖和六糖。本专利技术的一个代表性的磺酰化改性甘露寡糖中，各种寡糖所占比例如下表所示二糖 三糖 四糖 五糖 六糖比例 4.8％18％ 24％ 20％ 18％可 GMMM能 GGM GGMGGM结 MGMM GMMMM构GM MGM GGMMGMMMGM MGMMMMM GMM MMMGGMGGMM MMGGMMMM MGMMMMMGGM表中M＝甘露糖，G＝葡萄糖，各个糖单元间以β-1，4糖苷键连接，右边为还原端。按照本专利技术的磺酰化改性甘露寡糖，其中所述的甘露寡糖的自由羟基的磺化度优选为15-20％。按照本专利技术的磺酰化改性甘露寡糖，其中所述的甘露寡糖是利用嗜碱芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉而制备的。本专利技术的磺酰化改性甘露寡糖具有低抗凝血活性。含有治疗有效剂量的本专利技术的磺酰化改性甘露寡糖是一种新的易于吸收和低抗原性的抗病毒、抗肿瘤活性药物组合物。本专利技术还提供了如上所述的磺酰化改性甘露寡糖的制备方法，该方法包括如下步骤(1)将魔芋多糖溶于氢氧化钠溶液中，用盐酸溶液将其中和至PH值为7后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磺酰化改性甘露寡糖，其中的甘露寡糖的结构通式如下：Ｒ↓［１］－（Ｒ↓［ｘ］）↓［ｎ］－Ｒ↓［２］其中，ｎ为０或１－３之间的整数，Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］以及每一个Ｒ↓［ｘ］代表一个单糖单元，相邻的单糖单元由β－１，４糖苷键连接，右 边为还原端，甘露寡糖的自由羟基的磺化度为１０－３０％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马延和，田耕，薛燕芬，刘颍，张志钢，周培谨，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]