β-D-甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体的制备方法技术

一种β－Ｄ－甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体的制备方法，其特征是将β－Ｄ－甘露糖醛酸寡糖与牛血清白蛋白化学连接，免疫小鼠，取该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，进行选择性培养，经稀释进行克隆化，选择阳性克隆株，并大量扩增，注入同系小鼠腹腔诱生腹水或通过体外细胞培养，分离获得β－Ｄ－甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体。它可用于β－Ｄ－甘露糖醛酸寡糖的检测、测定、质量标准、纯化以及阻断β－Ｄ－甘露糖醛酸寡糖的生物效应，使用方便。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种β-D-甘露糖醛酸寡糖，特别是涉及一种β-D-甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体的制备方法。β-D-甘露糖醛酸寡糖(HSH-971)是从海藻中分离提取得到的一种低分子量酸性寡糖类物质，其重均分子量为2000道尔顿。专利技术人在研制该糖类物质的多年实践中认识到，其结构复杂，没有特征性紫外吸收光谱，缺乏特定标准化定量检测方法。因而在HSH-971的检测、测定、质量标准、免疫纯化以及阻断HSH-971的生物效应等诸多方面都存在困难。本专利技术的目的是提供一种β-D-甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体的制备方法，它制备出的单克隆抗体能解决现有技术中的上述困难。一种β-D-甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体的制备方法，其特征是将β-D-甘露糖醛酸寡糖与牛血清白蛋白化学连接，制出免疫复合物免疫小鼠，取该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以选择性培养基进行选择性培养，经稀释进行克隆化，选择阳性克隆株，并大量扩增，注入同系小鼠腹腔诱生腹水或通过体外细胞培养，分离获得β-D-甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体。本专利技术制备的β-D-甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体可用于β-D-甘露糖醛酸寡糖的检测、测定、质量标准、纯化以及阻断β-D-甘露糖醛酸寡糖的生物效应，使用方便。下面通过实施例说明本专利技术。将450mg HSH-971溶解于0.4ml pH为4的醋酸钠盐缓冲液中，加入2.4％(重量百分浓度)的过碘酸钠水溶液，振荡30min，加入3ml 5％(体积百分浓度)的乙二醇水溶液，4℃下放置30min，用上述醋酸缓冲液透析过夜；加入20ml含有270mg牛血清白蛋白(BSA)的碳酸钠盐缓冲液，4℃下透析过夜；再加入40ml含300mg硼氢化钠(NaHB4)的水溶液，4℃下放置30min。至此完成了化学连接。将所得反应液浓缩至5ml，用分离柱Sephadex G-100分离，加入pH为7.4的磷酸缓冲液洗脱，制得BSA-HSH-971免疫复合物。将4mg BSA-HSH-971免疫复合物溶解于5ml生理盐水，与完全弗氏佐剂(CFA)1∶1(体积比)混合；取8周龄雌性Balb/c小鼠，作背部皮下多点注射完全弗氏佐剂与BSA-HSH-971混合物0.5ml；一周后再腹腔注射CFA与BSA-HSH-971混合物0.5ml，加强免疫，每周加强免疫一次；第4周末时取血检测抗体效价，用生理盐水将血清按1∶10000稀释后，进行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，以显色阳性为标准；细胞融合前三天，静脉注射0.25ml上述BSA-HSH-971免疫复合物。处死小鼠，制备单个脾细胞悬液，在50ml离心管中混合108个脾细胞和107个对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞(NS-1细胞)，并加入30ml单纯培养基，室温800转/分钟离心8分钟，去上清液，把离心管放于37℃水浴中，缓慢加入0.8ml 50％(重量百分比)聚乙二醇-4000，2分钟加入完毕，边加入边摇离心管，然后缓慢加入单纯培养基，3分钟内共加入4ml，室温800转/分钟离心8分钟，去上清液；加入45ml20％(体积百分比)小牛血清的HAT(次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)，浓度分别为H1×10-6mol/L，A4×10-9mol/L，T1.6×10-7mol/L)选择性培养基，吹打后接种于3块96孔板中，在空气中含有5％(体积百分比)CO2和37℃的条件下培养，7天后将培养板中的培养液加满，10天后观察，用ELISA法检测杂交细胞培养液的抗体效价。对效价比较好的杂交细胞进行增殖、传代，并逐渐换用HT(浓度分别为H10-6mol/L，T1.6×10-7mol/L)培养基，直至20％(体积百分比)小牛血清的培养基。取出抗体阳性孔细胞，用HT培养基将该细胞稀释成1个细胞/ml，接种到已接种脾细胞的96孔板中，每孔0.1ml，使细胞含量为2个/孔、1个/孔或0个/孔。在空气中含有5％(体积百分比)CO2和37℃的条件下培养。显微镜下观察，选出只有一个集落生长的孔，并大量扩增，检测培养上清中的抗体。对抗体阳性孔细胞，大量扩增，得到克隆株三株。取8周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后接种杂交瘤细胞106/只，7-10天后收集腹水，12000转/分钟离心30分钟，收集上清液，加入1/10000(重量百分比)NaN3(叠氮钠)水溶液，-20℃下保存。以Sepharose CL-4B Protein A柱(Immunopure(A)IgG Purification Kit)分离制得本专利技术的HSH-971单克隆抗体。经过分析，本专利技术的单克隆抗体与HSH-971的亲和力常数为5×10-7-2×10-9，与肝素、乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、透明质酸等人体内多糖和褐藻酸等结构类似的多糖均无交叉反应。经8个月连续传代，冻存一年，复苏两次，该单克隆抗体的分泌能力无明显变化；该抗体在37℃保存一周，效价无明显变化；该抗体亚类分别为IgG1(κ)、IgG2a(κ)，染色体条数为92-96条。该抗体可用于HSH-971的检测、测定、质量标准、纯化，以及阻断HSH-971的生物效应。本实施例中从小鼠腹腔诱生腹水的步骤亦可改用体外细胞培养，具体方法是将克隆株细胞以含15％小牛血清的培养基培养，收集培养上清液，以Sepharose CL-4B Protein A柱(Immunopure(A)IgGPurification Kit)分离制备本专利技术的HSH-971单克隆抗体。权利要求1.一种β-D-甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体的制备方法，其特征是将β-D-甘露糖醛酸寡糖与牛血清白蛋白化学连接，制出免疫复合物免疫小鼠，取该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以选择性培养基进行选择性培养，经稀释进行克隆化，选择阳性克隆株，并大量扩增，注入同系小鼠腹腔诱生腹水或通过体外细胞培养，分离。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的β-D-甘露糖醛酸寡糖与牛血清白蛋白化学连接是在醋酸钠盐缓冲液中并加入过碘酸钠水溶液的条件下进行的。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的免疫小鼠是将牛血清白蛋-β-D-甘露糖醛酸寡糖免疫复合物溶解于生理盐水并与完全弗氏佐剂(CFA)混合对小鼠作背部皮下多点注射。全文摘要一种，其特征是将β－D－甘露糖醛酸寡糖与牛血清白蛋白化学连接，免疫小鼠，取该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，进行选择性培养，经稀释进行克隆化，选择阳性克隆株，并大量扩增，注入同系小鼠腹腔诱生腹水或通过体外细胞培养，分离获得β－D－甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体。它可用于β－D－甘露糖醛酸寡糖的检测、测定、质量标准、纯化以及阻断β－D－甘露糖醛酸寡糖的生物效应，使用方便。文档编号C12P21/08GK1401786SQ0113511公开日2003年3月12日 申请日期2001年11月15日 优先权日2001年11月15日专利技术者耿美玉, 辛现良, 管华诗 申请人:青岛海洋大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β－Ｄ－甘露糖醛酸寡糖单克隆抗体的制备方法，其特征是将β－Ｄ－甘露糖醛酸寡糖与牛血清白蛋白化学连接，制出免疫复合物，免疫小鼠，取该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以选择性培养基进行选择性培养，经稀释进行克隆化，选择阳性克隆株，并大量扩增，注入同系小鼠腹腔诱生腹水或通过体外细胞培养，分离。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：耿美玉，辛现良，管华诗，
申请(专利权)人：青岛海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]