一种高浓度γ‑聚谷氨酸及其发酵方法技术

本发明专利技术涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种高浓度γ‑聚谷氨酸及其发酵方法，该发酵方法包括如下步骤：（1）将产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌接种到含有Span20的发酵培养基中进行发酵培养；（2）在发酵培养5‑7h，添加一定量正十二烷；（3）在发酵培养5‑7h开始，每隔3‑5h，添加一定量H2O2；（4）从发酵培养18‑24h开始，流加蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液和酵母粉溶液，流加至56‑78h，发酵结束；（5）分离提取发酵液中的γ‑聚谷氨酸。本发明专利技术的发酵方法可以解决菌体生长过程中供氧不足的难题，在低成本的液体培养基中实现γ‑聚谷氨酸的高产，还具有成本低、效率高、环境污染低、不增加能耗等优点。

A high concentration of gamma polyglutamic acid and its fermentation method

The present invention relates to the field of microbial fermentation technology, in particular to a high concentration of gamma poly glutamic acid fermentation, the fermentation method comprises the following steps: (1) the production of gamma polyglutamic acid bacillus subtilis fermentation inoculated into Span20 containing culture medium for fermentation culture; (2) 5 7h in fermentation, adding a certain amount of twelve alkyl; (3) 5 7h at the beginning of fermentation culture, every 3 5h, adding a certain amount of H2O2; (4) 18 24h from the beginning of fermentation, adding sucrose solution, sodium glutamate solution and yeast powder solution, adding to 56 (78h, the end of fermentation; 5) extraction of gamma in fermentation of polyglutamic acid. Fermentation method of the invention can solve the problem of insufficient oxygen supply during the growth of mycelium in liquid culture, in the low cost of implementation of gamma poly glutamic acid medium has the advantages of low cost, high yield, high efficiency, low environmental pollution, increasing energy consumption etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及一种高浓度γ-聚谷氨酸及其发酵方法。
技术介绍
γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamicacid，简称γ-PGA）是一种氨基酸聚合物，由L/D-谷氨酸通过γ-聚谷酰键连接而成，其分子量一般在100-1000KDa之间，相当于500-5000个谷氨酸单体聚合而成。γ-聚谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。γ-聚谷氨酸的主要发酵方法有化学合成法、提取法和生物合成法。相比于生物合成法，前两种方法工艺复杂、副产物多、产量低、环境污染较大。目前，国内外主要是利用以芽孢杆菌为代表的微生物来发酵生产γ-聚谷氨酸。在二十世纪九十年代以来，科研工作者们在筛选γ-聚谷氨酸高产菌株及改善γ-聚谷氨酸的发酵工艺方面做了大量的研究工作。Kubota从土壤中分离得到一株BacillussubtilisF201，γ-聚谷氨酸的最大产量可达到50g/L。Yoon对BacilluslicheniformisATCC9945a利用高密度流加培养，在发酵35h后，γ-聚谷氨酸的产量达到最大值39g/L。江波等从土壤中筛选一株Bacillusmethylotrophicus，该菌株可不依赖于谷氨酸进行发酵，产量达到17g/L，其专利公开号为CN102268389。乔长冕等通过向培养基中添加硝酸钠，调节聚谷氨酸合成酶的活性，提高了谷氨酸的转化率，γ-聚谷氨酸的产量达到45-55g/L，其专利公布号为CN103695485。目前利用微生物发酵生产γ-聚谷氨酸的过程中，合成代谢途径较为复杂，发酵液极其粘稠，发酵液的高粘度显著降低了溶氧浓度，并大大增加了传质阻力系数，使得氧气供给困难，营养物质得不到有效利用。这极大地限制了菌体的生长代谢，最终导致γ-聚谷氨酸产量较低。因此，寻找一种改善培养菌体的低氧环境及提高发酵液的传质系数，是目前发酵生产γ-聚谷氨酸亟待解决的问题。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，该发酵方法可以解决菌体生长过程中供氧不足的难题，在低成本的液体培养基中实现γ-聚谷氨酸的高产。本专利技术的另一目的在于提供一种高浓度γ-聚谷氨酸。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，包括如下步骤：（1）将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌接种到含有Span20的发酵培养基中进行发酵培养；（2）在发酵培养5-7h，添加一定量的正十二烷；（3）在发酵培养5-7h开始，每隔3-5h，添加一定量的H2O2；（4）从发酵培养18-24h开始，流加蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液和酵母粉溶液，流加至56-78h，发酵结束；（5）分离提取发酵液中的γ-聚谷氨酸。表面活性剂Span20具有改善发酵环境的作用，它的非极性端结合在菌体表面，能够使菌体分散度增加，强化传质效果。此外，Span20还能提高细胞膜的通透性，增加菌体细胞的摄氧速率。为了在不增加能耗的情况下，进一步改善菌体生长的低氧环境，本专利技术一方面进行了氧载体强化溶氧的研究，在载体中氧气的溶解度比在水中的溶解度高很多。氧载体增加溶氧的方法与提高通气量强化溶氧的方法相比，具有氧气传递速率快、利用率高、能耗低、气泡少、液体剪切力小等优点。因此，氧载体的方法非常适合应用于γ-聚谷氨酸的发酵生产，本专利技术选取了正十二烷进行研究，它与Span20共同作用取得了更佳的实验效果。在另一方面，本专利技术通过添加合适浓度的H2O2来增加氧气的供应，并对菌体细胞产生一定的氧化胁迫，刺激更多γ-聚谷氨酸的形成，此种方法具有成本低、效率高、环境污染低、不增加能耗等优点。本专利技术与相应的不添加Span20、正十二烷和H2O2的方法相比可获得更多的γ-聚谷氨酸，在本专利技术的具体实施方式中，γ-聚谷氨酸的产量达到55g/L左右。在本专利技术中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌为本邻域技术人员所熟知，如本专利技术
技术介绍
部分所提及的，本专利技术优选采用的枯草芽孢杆菌将在下文中更详尽地描述；枯草芽孢杆菌的发酵温度为34-38℃，本专利技术优选采用37℃。优选的，所述步骤（1）中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是于2014年5月20日保藏于波顿香料有限公司保藏中心的枯草芽孢杆菌PBS55，其保藏编号为CMCC3366。优选的，所述步骤（1）中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是在种子培养基中活化培养而获得的，种子培养基包括如下组分：蛋白胨10-30g/L、酵母粉4-20g/L、氯化钠10-20g/L、硫酸镁0.5-4g/L、磷酸二氢钾1-8g/L和氯化铵2-10g/L，pH为6.0-8.0。更为优选的，种子培养基包括如下组分：蛋白胨为12-18g/L，酵母粉为6-12g/L，氯化钠为12-16g/L，硫酸镁1-3g/L，磷酸二氢钾1.5-5g/L，氯化铵为3-6g/L，pH为6.5-7.5。在本专利技术中，如未特别指出培养基中的添加物，培养基仅仅是未添加相应添加物的培养基。优选的，所述步骤（1）中，发酵培养基包括如下组分：蔗糖30-100g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-20g/L、谷氨酸钠20-80g/L、硫酸镁0.5-3g/L和磷酸二氢钾2-5g/L，pH为6.5-7.5。更为优选的，所述步骤（1）中，发酵培养基包括如下组分：蔗糖40-100g/L、蛋白胨15-20g/L、酵母粉6-12g/L、谷氨酸钠30-70g/L、硫酸镁1-2g/L和磷酸二氢钾2-3g/L，pH为6.8-7.2。优选的，所述步骤（1）中，培养参数为：培养温度为34-38℃，搅拌转速300-400r/min，通气量1-2vvm，罐压0.04-0.1mPa。更为优选的，所述步骤（1）中，培养参数为：培养温度为37℃，搅拌转速350r/min，通气量1.5vvm，罐压0.08mPa。优选的，所述步骤（1）中，Span20的添加量为1-10ml/L；所述步骤（2）中，正十二烷的添加量为10-60ml/L；所述步骤（3）中，H2O2的添加量为3-20ml/L。更为优选的，所述步骤（1）中，Span20的添加量为2-6ml/L；所述步骤（2）中，正十二烷的添加量为20-40ml/L；所述步骤（3）中，H2O2的添加量为5-10ml/L。优选的，所述步骤（4）中，蔗糖溶液的质量浓度为45-55%，流加速度为每小时6-12mL/L；酵母粉溶液的质量浓度为15-25%，流加速度为每小时3-6mL/L；谷氨酸钠溶液的质量浓度为45-55%，流加速度为每小时4-8mL/L。更为优选的，所述步骤（4）中，蔗糖溶液的质量浓度为50%，流加速度为每小时6-12mL/L；酵母粉溶液的质量浓度为20%，流加速度为每小时3-6mL/L；谷氨酸钠溶液的质量浓度为40%，流加速度为每小时4-8mL/L。本专利技术在发酵罐上，通过连续留加底物方式控制菌体的生长和代谢，进一步促进了γ-聚谷氨酸的生成。分别在不同时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高浓度γ‑聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌接种到含有Span20的发酵培养基中进行发酵培养；（2）在发酵培养5‑7h，添加一定量的正十二烷；（3）在发酵培养5‑7h开始，每隔3‑5h，添加一定量的H2O2；（4）从发酵培养18‑24h开始，流加蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液和酵母粉溶液，流加至56‑78h，发酵结束；（5）分离提取发酵液中的γ‑聚谷氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌接种到含有Span20的发酵培养基中进行发酵培养；（2）在发酵培养5-7h，添加一定量的正十二烷；（3）在发酵培养5-7h开始，每隔3-5h，添加一定量的H2O2；（4）从发酵培养18-24h开始，流加蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液和酵母粉溶液，流加至56-78h，发酵结束；（5）分离提取发酵液中的γ-聚谷氨酸。2.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是于2014年5月20日保藏于波顿香料有限公司保藏中心的枯草芽孢杆菌PBS55，其保藏编号为CMCC3366。3.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是在种子培养基中活化培养而获得的，种子培养基包括如下组分：蛋白胨10-30g/L、酵母粉4-20g/L、氯化钠10-20g/L、硫酸镁0.5-4g/L、磷酸二氢钾1-8g/L和氯化铵2-10g/L，pH为6.0-8.0。4.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，发酵培养基包括如下组分：蔗糖30-100g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-20g/L、谷氨酸钠20-80g/L、硫酸镁0.5-3g/L和磷酸二氢钾2-5g/L，pH为6.5-7.5。5.根据权利要求4所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊，朱晖，陈小敏，蔡宇正，
申请(专利权)人：东莞波顿香料有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44