一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法，混悬液制剂中微球载体为内层为海藻酸盐核芯，外被壳聚糖层的双层微球，称其为海藻酸盐‑壳聚糖微球载体。所制备混悬液制剂中的载重组戊肝蛋白微球的平均粒径分布在6.73微米～8.39微米之间，形态均一。混悬液制剂中重组戊肝蛋白终浓度为60微克/毫升（包括微球载体吸附的重组戊肝蛋白和未吸附游离的重组戊肝蛋白），通过对混悬液外液的重组戊肝蛋白的测定，计算出微球载体对重组戊肝蛋白的吸附率大于90%。载重组戊肝蛋白微球混悬剂较同等剂量以氢氧化铝作为佐剂的重组戊肝疫苗可更好的刺激实验动物产生针对戊肝的免疫反应，这在实际应用中具有较大意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法，属于生物制剂制备

技术介绍
戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）基因组全长7.2kb，包含3个部分重叠的ORF，其中ORF2含有重要的中和抗原表位。目前已有ORF2许多片段在不同表达系统中成功的进行了表达。HEV尚无适合的细胞培养系。现上市或在研的HEV疫苗均为基因工程表达的重组HEVORF2抗原蛋白的亚单位疫苗。我国进行HEV疫苗规模化生产研究的只有两家公司，已上市的（厦门万泰，重组HEVP239蛋白）和进行临床试验（长春生物制品研究所有限责任公司，重组HEVP179蛋白）的重组戊型肝炎疫苗皆使用氢氧化铝作为重组蛋白的佐剂，但是以氢氧化铝作为佐剂，对重组蛋白类疫苗的免疫增强作用有限，不能刺激机体产生更强的针对HEV的免疫反应。并且由于国内HEV疫苗产品较少，对HEV疫苗新剂型，新的后续产品研究也较少。微球药物载体是近年药物应用新工艺、新技术中的一个突出代表。已有30多类药物在近年采用微球或微胶囊化技术，如解热镇痛药、抗生素、多肽、避孕药、维生素、抗癌药以及诊断用药等。这种药物传送技术在中药或化药中技术比较成熟，但在生物制品等蛋白质药物的应用仍处在研究阶段。微球载药技术在研发预防和治疗性疫苗领域也受到关注。不同粒径大小的微粒在体内分布范围也不同，通常粒径在2.5~10微米时，大部分积集于巨噬细胞；小于7微米时一般被肝、脾中的巨噬细胞摄取；0.2~0.4微米的微粒集中于肝后迅速被肝清除；小于0.01微米的微粒则缓慢积集于骨髓。由此可见，当粒径范围分布在2.5~10微米时，微粒更容易被吞噬细胞摄取，刺激机体产生免疫反应，但一般重组表达制备的抗原蛋白粒径均为纳米范围，无法直接引起有效的特异性免疫反应，加入铝佐剂后，铝盐形成的聚合体不能形成紧实的具有规则粒径分布的微粒，尤其在剪切力及机体自身流体力学环境下其松散的聚合体更容易被打散，形成更为宽泛的粒径分布范围，限制了其吸附的抗原在机内的分布，影响了巨噬细胞对抗原的摄取率，进而影响机体对抗原产生的特异性免疫应答。而微球载体具有较规则的粒径分布范围，对剪切力及流体力学的影响较小，使用后其粒径变化幅度甚微，能更容易的被巨噬细胞吞噬，从而引发机体的特异性免疫反应，并且作为疫苗的传递与储存系统，微球载体可对抗原蛋白进行局部浓集和缓慢的释放，在局部高浓度并持续刺激的情况下使机体产生比常规佐剂（铝盐佐剂）更强烈、更特异的免疫反应。海藻酸盐-壳聚糖微球制备条件温和,需要较少有机溶剂,制备过程中对活性蛋白质的破坏较少，特别适合于有生物活性的蛋白质类药物,且其来源丰富,成本低廉,是很有前途的重组抗原载体。海藻酸盐为多糖类化合物，常用稀碱从褐藻中提取制备。海藻酸钠可溶于不同温度的水中，不溶于乙醇、乙醚及其它有机溶剂。可与甲壳素或聚赖氨酸合用为复合材料。因海藻酸钙不溶于水，故海藻酸钠可用氯化钙固化成囊。甲壳素脱乙酰基后能溶于水称之为壳聚糖，甲壳素和壳聚糖是迄今为止唯一发现的阳离子动物纤维。壳聚糖具有一定的生物降解性，其分解产物无毒，具有增强药物吸收、抗菌消炎、促进伤口愈合、降低胆固醇、抑制肿瘤细胞的作用。乳化法制备海藻酸盐微球核芯时通常使用食用油，但由于食用油存在较为明显的批间差异，对核芯形成及核芯粒径分布影响较大，而改用液体石蜡则避免了因为油相的批间差异及油溶性杂质对核芯形成的影响。现研究的在蛋白微球制剂为将蛋白药物包裹进微球内部，而因为蛋白质并不像化学药物一样存在明显的油水分布性质，所以在用乳化法制备载蛋白的海藻酸盐-壳聚糖制剂时部分蛋白质溶于油相使得微球中载蛋白数量减少，严重影响微球制剂的包封率，但由于壳聚糖分子链上有大量的伯氨基，海藻酸钠的分子链上有大量的羧基，所以壳聚糖和海藻酸盐可以通过正负电荷吸引形成聚电解质膜。由于重组的戊肝蛋白大多带有负电荷，可以和海藻酸盐-壳聚糖微球载体的外层带有正电荷的壳聚糖层相互吸引，并吸附其上，获得载重组戊肝蛋白的海藻酸盐-壳聚糖微球，并且制备的载戊肝蛋白海藻酸盐-壳聚糖微球混悬液制剂是将蛋白原液与微球混合，混悬液中的蛋白质与微球表面的吸附存在动态平衡，使得微球对蛋白有着较高的吸附率，并且并无蛋白质的损失，制备方法简单，而且更为经济。
技术实现思路
：本专利技术提供一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法，使用海藻酸盐-壳聚糖微球作为重组戊型肝炎病毒抗原蛋白的载体，在国内的戊型肝炎疫苗的研究中属首创，填补了戊肝疫苗剂型研究的空白。混悬液制剂中微球载体为内层为海藻酸盐核芯，外被壳聚糖层的双层微球，称其为海藻酸盐-壳聚糖微球载体。所制备混悬液制剂中的载重组戊肝蛋白微球的平均粒径分布在6.73微米～8.39微米之间，形态均一。混悬液制剂中重组戊肝蛋白终浓度为60微克/毫升（包括微球载体吸附的重组戊肝蛋白和未吸附游离的重组戊肝蛋白），通过对混悬液外液的重组戊肝蛋白的测定，计算出微球载体对重组戊肝蛋白的吸附率大于90%。本专利技术所述的载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的的制备方法，包括如下步骤：1、微球载体的海藻酸盐核芯的制备制备方法为乳化法，浓度为1%～1.5%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液为水相，以液体石蜡为油相，水相与油相体积比为1:2，以单一乳化剂或混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为1%~4%（乳化剂体积/油相体积），油水界面平衡值（HLB值）控制在4~6，预乳化转速控制在50转/分钟~500转/分钟，预乳化时间控制在5~30分钟，乳化转速控制在500转/分钟~2000转/分钟，乳化时间控制在5~30分钟，固化剂为经115℃高压灭菌30分钟的氯化钙水溶液，其浓度为5%~20%，固化液与乳液体积比为1:1~1:3，固化液滴入速度为3毫升/分钟~20毫升/分钟，继续固化时间为10~120分钟。海藻酸钙微球经油水相分离后用无菌注射用水或无菌蒸馏水冲洗3~5遍，离心分离，得微球载体海藻酸盐核芯；2、获得的海藻酸盐核芯包被壳聚糖层制备海藻酸盐-壳聚糖微球载体将步骤1）中获得的海藻酸盐核心悬浮于浓度为0.1%~0.8%经115℃高压灭菌30分钟的壳聚糖水溶液中，在25℃~42℃，转速为50转/分钟~200转/分钟摇床中温育10~60分钟，经1000转/分钟~5000转/分钟离心1~30分钟，无菌注射用水或无菌蒸馏水冲洗3~5次，获得海藻酸盐-壳聚糖微球载体；3、重组戊肝蛋白微球制剂的制备向步骤2）中获得的海藻酸盐-壳聚糖微球载体加入重组戊肝蛋白水溶液，并用无菌注射用水定容至与1中所用的水相相同的体积，使最后抗原蛋白含量在60微克/毫升，在25℃~42℃，转速为50转/分钟~200转/分钟摇床中温育10~60分钟，制备出载戊肝蛋白微球混悬液制剂，混匀后无菌分装，2℃~8℃保存，使用前悬匀。所制备的混悬液中载重组戊肝蛋白微球平均粒径分布在6.73微米～8.39微米之间，形态均一。通过对混悬液制剂外液中重组戊肝蛋白含量测定，计算出微球载体对所载的戊肝蛋白的吸附率大于90%，吸附率计算方法如下：吸附率=（蛋白总量-混悬液外液蛋白总量）/蛋白总量×100%本方法制备的载重组戊肝蛋白混悬液制剂中未吸附的抗原蛋白仍留在混悬液中，符合药物吸附动态本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法，包括以下步骤：1）制备方法为乳化法，浓度为1%～1.5%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液为水相，以液体石蜡为油相，水相与油相体积比为1:2，以单一乳化剂或混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为1%~4%（乳化剂体积/油相体积），油水界面平衡值（HLB值）控制在4~6，预乳化转速控制在50转/分钟~500转/分钟，预乳化时间控制在5~30分钟，乳化转速控制在500转/分钟~2000转/分钟，乳化时间控制在5~30分钟，固化剂为经115℃高压灭菌30分钟的氯化钙水溶液，其浓度为5%~20%，固化液与乳液体积比为1:1~1:3，固化液滴入速度为3毫升/分钟~20毫升/分钟，继续固化时间为10~120分钟。

【技术特征摘要】
1.一种载重组戊肝蛋白微球混悬液制剂的制备方法，包括以下步骤：1）制备方法为乳化法，浓度为1%～1.5%经115℃高压灭菌30分钟的海藻酸钠水溶液为水相，以液体石蜡为油相，水相与油相体积比为1:2，以单一乳化剂或混合乳化剂作为乳化剂，乳化剂添加量为1%~4%（乳化剂体积/油相体积），油水界面平衡值（HLB值）控制在4~6，预乳化转速控制在50转/分钟~500转/分钟，预乳化时间控制在5~30分钟，乳化转速控制在500转/分钟~2000转/分钟，乳化时间控制在5~30分钟，固化剂为经115℃高压灭菌30分钟的氯化钙水溶液，其浓度为5%~20%，固化液与乳液体积比为1:1~1:3，固化液滴入速度为3毫升/分钟~20毫升/分钟，继续固化时间为10~120分钟。2.海藻酸钙微球经油水相分离后用无菌注射用水或无菌蒸馏水冲洗3~5遍，离...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐剑光，迟祥，杨屹，李铮，贾媛，陈子杨，时成波，迟春萍，曹玉锋，孟多佳，
申请(专利权)人：长春生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22