一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因、细菌漆酶及其应用制造技术

一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因、细菌漆酶及其应用，属于生物技术领域，具体涉及一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因cahh1、由该基因表达的细菌漆酶CAHH1以及该细菌漆酶CAHH1在纺织工业和环境保护等领域中的应用。与传统漆酶相比，细菌漆酶CAHH1具有明显的应用稳定性优势和作用广谱性优点，主要包括：(1)细菌漆酶CAHH1在pH＝3‑9的范围内具有较好的酸碱稳定性，(2)细菌漆酶CAHH1在温度为30℃‑90℃的范围内均具有较好的温度稳定性，(3)细菌漆酶CAHH1对靛蓝类染料、偶氮类染料和三苯甲烷类染料的脱色作用均强，可用于工业染料的脱色，有广阔的应用前景，而且易实现工程化制备，有较高的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因cahh1、由该基因表达的细菌漆酶CAHH1以及该细菌漆酶CAHH1在纺织工业和环境保护等领域中的应用。
技术介绍
漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，它可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香类化合物，同时将分子氧还原成水。由于漆酶作用的底物范围十分广泛、催化效率高，所以在造纸工业(生物制浆和漂白)、纺织工业(人工合成染料脱色)、食品工业(食品风味改良)、饲料营养改善、新型药物开发、土壤的生物修复、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值。漆酶广泛存在于高等真菌(特别是担子菌)中。近年来，部分真菌漆酶已经应用于多个工业领域，如来自黑曲霉的漆酶DeniliteⅡS等。但是真菌漆酶受环境影响比较大，在碱性条件下活性较低，这严重影响了它在工业领域中的应用。随着全基因组测序技术的迅速发展，人们发现，漆酶在细菌中同样广泛存在。细菌漆酶在碱性环境和高温条件下具有良好的催化活性和较高的稳定性，并且具有生长快、易于培养的特点。由于工业染料废水等一般温度较高，碱性较强，真菌漆酶在实际应用中表现出稳定性较差，而这种环境却不影响细菌漆酶功能的发挥，因此细菌漆酶在工业上具有更好的应用前景。虽然目前对细菌漆酶资源的发掘还很有限，但迄今已经在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等微生物中发现了漆酶。随着印染工业的迅速发展，染料的品种和数量不断增加，全球每年至少有10％的染料通过废水排放到自然环境中，这些废水中的染料很多是具有毒性或致癌性的，严重危害了水生动物以及人类本身。纺织、造纸和塑胶等行业产生的染料废水往往不能有效的零污染处理，导致了大量工业染料废水的排放。而工业使用的合成染料绝大多数是芳香族化合物，使用传统的方法无法有效去除废水中的染料，而且非常耗能，但相比之下，应用漆酶来处理工业染料废水既经济、有效、又环境友好，是目前和未来较理想的治理方法。真菌漆酶虽然对纺织染料的脱色及降解效果明显，但产漆酶的真菌因较细菌生长缓慢、发酵周期长、生长温度和pH范围较窄而限制了真菌漆酶的应用，而产漆酶的细菌因具有生长迅速、发酵周期短、耐温、在碱性条件下稳定等特点而在工业上具有更好的应用前景和实用价值。目前关于细菌漆酶在染料降解与脱色方面的研究报道还相对较少，通过研究细菌漆酶对不同合成染料的脱色效果，可以进一步推动细菌漆酶的在工业上的应用。靛蓝类染料、偶氮类染料、蒽醌染料和三苯甲院类染料是目前工业是上用量最大的四类染料，也是较难降解的染料。目前世界各国都在致力于开发能有效降解这四类染料的细菌漆酶，以期实现有效保护和修复生态环境，但是前提是要开发出理想的细菌漆酶。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因cahh1；本专利技术的另一个目的是利用上述细菌漆酶基因cahh1制备高效、广谱的细菌漆酶CAHH1，即应用基因工程技术利用细菌表达系统进行漆酶的表达与制备；本专利技术的再一个目的是通过对细菌漆酶CAHH1的理化性质的分析，提供细菌漆酶CAHH1在工业染料降解和脱色中的用途。本专利技术所述的一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因cahh1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述的一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶CAHH1，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术所述的细菌漆酶基因cahh1来自枯草杆菌ZNXH1，我们发现，该菌所分泌的蛋白具有漆酶的活力，经进一步研究确定该菌的基因组中含有漆酶基因。将枯草杆菌ZNXH1通过菌体培养、目的基因钓取，得到本专利技术所述的细菌漆酶基因cahh1。我们委托上海生工生物技术有限公司对该基因进行测序，测序结果如图3所示，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。将本专利技术的细菌漆酶基因cahh1与表达载体重组，形成重组表达载体，本专利技术不限于特定的表达载体，优选的表达载体是原核表达载体[pET-28a、pET-41b等系列的pET表达载体(通用的大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、N-或C-末端组氨酸标签以及卡那霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售)或pPZW103等表达载体(枯草杆菌表达载体，含有P43强启动子以及卡那霉素抗性基因等，参见黄鹤等，“重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化”，中国生物化学与分子生物学报，2001，17(2):173-177)]。上述重组表达载体按生物学常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细胞包括真核表达细胞和原核表达细胞。本专利技术不局限于任何特定的宿主细胞，优选的宿主细胞是大肠杆菌或枯草杆菌，进一步优选的大肠杆菌宿主细胞为E.coliBL21(DE3)或E.coliBL21(DE3)pLysS、E.coliBL21(DE3)pLysE(通用的大肠杆菌表达宿主细胞，Novagen、Invitrogen等公司有售)，进一步优选的枯草杆菌宿主细胞为WB600(参见黄鹤等，“重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化”，中国生物化学与分子生物学报，2001,17(2):173-177)，表达载体导入宿主细胞后得到表达细菌漆酶CAHH1的工程菌。工程菌表达的漆酶为可溶性漆酶蛋白。针对不同的宿主细胞，表达产物的纯化有不同的方法。1、针对大肠杆菌宿主细胞表达的胞内漆酶蛋白(胞内酶)，通过表达细胞超声破碎和加热失活大肠杆菌杂蛋白即可分离得到细胞可溶性漆酶蛋白，再使用Ni2+-NTA亲和柱纯化得到纯化的漆酶蛋白；2、针对枯草杆菌宿主细胞表达的胞外漆酶蛋白(胞外酶)，通过表达体系细胞的离心分离获得枯草杆菌表达细胞的培养液，再通过加热失活培养液中的杂蛋白即可分离纯化得到表达细胞分泌的漆酶蛋白。表达的漆酶蛋白经活性实验鉴定，具有漆酶的活性，可催化多种染料等底物的脱色。该种漆酶蛋白即为本专利技术所述的细菌漆酶CAHH1，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。与传统漆酶相比，它具有明显的应用稳定性优势和作用广谱性优点，主要包括：(1)本专利技术的细菌漆酶CAHH1在pH＝3-9的范围内具有较好的酸碱稳定性，(2)本专利技术的细菌漆酶CAHH1在温度为30℃-90℃的范围内均具有较好的温度稳定性，(3)本专利技术的细菌漆酶CAHH1对靛蓝类染料、偶氮类染料和三苯甲烷类染料的脱色作用均强，可用于工业染料的脱色。以上技术方案中所有分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)进行。附图说明图1：细菌漆酶基因cahh1产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中M：DNA分子Marker；S：细菌漆酶基因cahh1，在分子量1542bp处有明亮条带；图2：重组表达载体pET28a-CAHH1构建示意图；图3：细菌漆酶基因cahh1测序谱图，共测二个反应，进一步使用Gene-man软件组装得到全长的细菌漆酶基因(1542bp)；图4：纯化得到的细菌漆酶CAHH1的SDS-PAGE电泳图谱，其中M：蛋白质分子Marker；1：纯化的细菌漆酶CAHH1；图5：细菌漆酶CAHH1的pH-活力曲线(A)和pH稳定性曲线(B)；图6：细菌漆酶CAHH1的温度-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因cahh1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因cahh1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶CAHH1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求2所述的一种来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶CAHH1，其特征在于：是由权利要求1所述的来源于枯草杆菌ZNXH1的细菌漆酶基因cahh1与表达载体重组，将重组后的表达载体导入原核表达细...

【专利技术属性】
技术研发人员：张应玖，金兰娜，杨雪，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22