基于核因子κB易位预测化合物的毒性的方法技术

提供了一种筛选化合物毒性的方法。该方法包括使测试化合物与测试细胞群接触，所述测试细胞群中核因子(NF)‑κB在接触之前未被激活；接触后确定测试群中NF‑κB的核定位水平；以及与未与测试化合物接触的对照群的NF‑κB的核定位水平相比较。相对于对照群，测试群的NF‑κB的核定位水平的增加表明测试化合物损伤细胞和/或诱导促炎反应，因此对该方法中使用的细胞类型有毒性的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求提交于2014年3月17日的SG临时申请号10201400705X的权益和优先权，其内容据此通过引用并入本文中。
本专利技术涉及预测化合物毒性的体外方法，包括器官特异性毒性或组织特异性毒性。
技术介绍
转录因子的NF-κB家族(在此统称为NF-κB)是在动物和人中的炎症和应激反应的主导调节因子[1,2]。NF-κB被广泛(ubiquitously)表达，并通常以未激活状态保持在细胞质中[3,4]。NF-κB可以由大量各种不同的应激因子激活，包括细胞因子、细菌毒素、病毒产物、低氧、活性氧和紫外光[3-5]。通过激活，NF-κB迅速易位进入核中，在核中它调节大量的靶标基因。由于NF-κB靶向的基因的数量和种类，NF-κB激活与许多疾病包括癌症[1,6]和炎症疾病比如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、多发性硬化、炎症肠病以及溃疡性结肠炎[7]有关。这些疾病影响各种器官系统，比如肺、肠、心血管系统或中枢神经系统。NF-κB激活还与各种形式的肾疾病有关[8,9]。在特定的细胞类型中NF-κB被激活，所述特定的细胞涉及疾病过程或受某些应激因素(stressors)影响。转录因子的NF-κB家族由不同的蛋白亚基的同二聚体或异二聚体组成。迄今，已经鉴定了五种蛋白亚基[5]。很多NF-κB调节的靶标基因涉及炎症反应；然而被靶向的基因的精确组取决于NF-κB的同种型和涉及的亚基。NF-κB的p65亚基是促炎白细胞介素(IL)IL-6和IL-8的激活所必需的[10-12]。
技术实现思路
提供了一种用于预测化合物的器官特异性或组织特异性毒性的体外测定，由化合物激活NF-κB并诱导其核易位的能力反映。所述测定基于NF-κΒ的核易位的检测，例如，NF-κΒ亚基p65的核易位。简要地，选择的细胞类型首先用可能有毒或无毒的待筛选化合物处理，然后测量NF-κΒ易位，以预测化合物的毒性以及其通过激活NF-κB诱导促炎NF-κB信号转导的能力。该测定适合高内涵筛选(HCS)，且在一些实施方式中，HCS可以是用于评估NF-κΒ易位的优选方法。所述测定可以使用原代体器官或组织特异性细胞或干细胞、干细胞衍生的器官特异性脊椎动物细胞、生殖细胞(germscells)或它们的前体、或者器官特异性或组织特异性建立的细胞系，即永生或永生化细胞系。在一个方面，本专利技术提供了一种筛选化合物的毒性的体外方法，所述方法包括：使测试化合物与测试细胞群接触，在所述测试细胞群中的核因子(NF)-κΒ在接触之前未被激活；在接触之后确定测试群中NF-κB的核定位水平；以及将测试群中NF-κB的核定位水平与未与测试化合物接触的对照细胞群中的NF-κB的核定位水平进行比较；其中相对于对照群，测试群中NF-κB的核定位水平的增加表明测试化合物损伤细胞和/或诱导促炎反应。在所述方法中评估的NF-κΒ可以是NF-κΒ的任何同种型或亚基。在一些实施方式中，NF-κΒ是NF-κΒ的p65亚基。在一些实施方式中，NF-κΒ的p65亚基包含如SEQIDNO:1至4中任一个所示的序列，或者SEQIDNO:5或6所示的序列。在所述方法中使用的细胞，包括测试细胞群和对照细胞群的细胞，可以是人细胞或者可以是非人动物细胞。细胞可以包含干细胞，包括例如胚胎干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、诱导性多能干细胞、组织特异性干细胞或器官特异性干细胞。细胞可以包含体细胞或衍生自干细胞的细胞。例如，细胞可以包含肿瘤细胞、生殖细胞或其前体、或者原代细胞。在一些实施方式中，细胞可以包含肝细胞、肾细胞、心血管细胞、中枢神经系统细胞、皮肤细胞、肺细胞、胰细胞、消化道细胞、眼细胞、耳细胞、骨髓细胞或血细胞。细胞可以包含肾近端小管细胞，包括例如人原代肾近端小管细胞。例如，细胞可以包含来自建立的细胞系的细胞，包括例如HK-2细胞或LLC-PK1细胞。例如，细胞可以包含衍生自干细胞的细胞，所述干细胞分化自：胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导性多能干细胞或器官/组织特异性干细胞。在一些实施方式中，细胞可以被至少部分分化成类肝细胞、肾细胞、心血管细胞、中枢神经系统细胞、皮肤细胞、肺细胞、胰细胞、消化道细胞、生殖细胞或其前体、眼细胞、耳细胞、骨髓细胞或血细胞。在一些实施方式中，所述细胞可以是肾近端小管样细胞。在所述方法中，接触在约1小时至约16小时、约12小时至约16小时、或约30至约36小时、或约3天的时间段内进行。所述方法还包括在确定之前，在至多4周的总时间段内以规律的间隔，重复一次或多次所述接触，包括其中对于接触的每次发生，接触进行相同时间段。所述方法还包括在至多4周的总时间段内以规律的间隔重复接触，随后进行一次或多次确定，包括其中对于接触的每次发生，接触进行相同时间段。结合所附表和附图，在综述本专利技术的具体实施方案的下列描述后，对于本领域普通技术人员来说，本专利技术的其它方面和特征将变得明显。附图说明在附图中只通过示例说明本专利技术的实施方案，附图如下：图1：比较先前基于NF-κB的测定和本专利技术的方法的实施方案的示意图。图2：用于检测化合物诱导的NF-κB易位的本专利技术的方法的高内涵筛选(HCS)实施方式的概述。图3：(含有表1)测试的41种不同化合物的NF-κB易位的热图。图4：(含有表2)测试的41种不同化合物的EC50值和确定的阳性细胞的最高百分比。图5：(含有表3)测试的42种不同化合物的NF-κB易位的定性分析。图6：灵敏度、特异性和与临床数据的总体一致性的图示。图7：(含有表4)测试的43种不同化合物的热图。图8：(含有表5)使用化合物诱导的NF-κB易位作为终点来预测药物诱导的近端小管毒性。图9：通过HCS成像的HPTC1(对照)。图10：在用直接损伤人近端小管的肾毒性剂处理后(以指示的浓度)，通过HCS成像的HPTC1。测定每种化合物的EC50和IC50值。图11：在用直接损伤人近端小管的肾毒性剂处理(以1000μg/mL)后，通过HCS成像的HPTC1。图12：在用对人近端小管细胞不直接有毒的化合物处理(以1000μg/mL)后，通过HCS成像的HPTC1。具体实施方式转录因子NF-κΒ的激活导致广泛表达的NF-κΒ从细胞质易位到核。NF-κΒ激活与许多疾病有关，结果是，对鉴定调节或抑制激活的NF-κΒ的活性的化合物感兴趣[7,13,14]。因此，以前已经开发了检测给定的测试化合物对NF-κΒ活性的作用的测定。这样的以前的测定使用已知诱导NF-κΒ核易位的激动剂，且因此激活，随后评估测试化合物对激动剂诱导的NF-κΒ核定位的作用。典型地，在这样的测定中使用的激动剂包括肿瘤坏死因子(TNF)-α或IL-1。因此，这些以前描述的测定涉及(address)细胞信号转导，包括调节NF-κΒ的信号转导通路，但是不涉及细胞毒性或待筛选测试化合物激活NF-κΒ的能力。与以前建立的使用激活剂/激动剂来激活NF-κΒ的基于NF-κΒ的测定不同，本方法基于这样的假设，即有毒的化合物对细胞施加应激，这种应激然后能够激活NF-κB且诱导它的核易位。因此，在此描述的方法中，测量测试化合物(不存在任何激活剂或激动剂)诱导NF-κB易位的能力，作为确定化合物毒性的方法。同样地，由测试化合物诱导的NF-κΒ的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选化合物的毒性的体外方法，所述方法包括：使测试化合物与测试细胞群接触，在所述测试细胞群中核因子(NF)‑κB在所述接触之前未被激活；在所述接触之后确定测试群中NF‑κB的核定位水平；和将测试群中NF‑κB的核定位水平与未与测试化合物接触的对照细胞群中的NF‑κB的核定位水平进行相比较；其中相对于对照群，测试群中NF‑κB的核定位水平的增加表明测试化合物损伤细胞和/或诱导促炎反应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.17 SG 10201400705X1.一种筛选化合物的毒性的体外方法，所述方法包括：使测试化合物与测试细胞群接触，在所述测试细胞群中核因子(NF)-κB在所述接触之前未被激活；在所述接触之后确定测试群中NF-κB的核定位水平；和将测试群中NF-κB的核定位水平与未与测试化合物接触的对照细胞群中的NF-κB的核定位水平进行相比较；其中相对于对照群，测试群中NF-κB的核定位水平的增加表明测试化合物损伤细胞和/或诱导促炎反应。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NF-κB是NF-κB的p65亚基。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述NF-κB的p65亚基包含SEQIDNO:1至4中任一个所示的序列。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述NF-κB的p65亚基包含SEQIDNO:5或6所示的序列。5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述测试群和对照群的细胞是人细胞。6.根据权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中所述测试群和对照群的细胞是非人动物细胞。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述测试群和对照群的细胞包含干细胞。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述干细胞包含胚胎干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、诱导性多能干细胞、组织特异性干细胞或器官特异性干细胞。9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述测试群和对照群的细胞包含体细胞或衍生自干细胞的细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞包含肿瘤细胞。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞包含原代细胞。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·津克，S·熊，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG