检测样品中基因毒性化合物的诊断系统和方法技术方案

本发明专利技术涉及一种诊断系统，包括：一种接触环境胁迫物质便能增加报道基因活性的转化微生物，此微生物具有应激诱导型启动子序列，启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，此核酸序列编码产生可检测的信号的报道分子；和另一种转化微生物，它具有组成型和非应激诱导型启动子序列，该启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，此核酸序列编码产生可检测的信号的报道分子。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
和现有技术国际专利申请PCT/EP96/01745描述了一种重组的核酸序列，和包含此核酸序列的宿主微生物，以及此宿主微生物用来检测样品中基因毒性化合物的用途。所述细菌基因毒性测验是根据生物发光，而使基因毒性化合物得到简易、迅捷、低成本的检测。此测验表现出与埃姆斯测验法和SOS显色法至少一样灵敏，且可给出基因毒性动力学测定，并同时评价受测化合物或材料的毒性(Van der Lelie等人，1977)。因此，称为VITOTOX的这种新测验被认为是一种有价值的、短期基因毒性和毒性测验，可用于许多不同目的。这种测验基于含lux操纵子的细菌，lux操纵子源于弗氏弧菌(Vibriofishcheri)，其转录受到recN基因的调控，是SOS系统的一部分。这种细菌在基因毒性化合物存在的条件下培养后，recN启动子被去阻遏，导致lux操纵子表达。这种表达在基因毒性作用下导致光的产生。起初，此测验是利用经改造的大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的不同菌株而完成的。作为周知的用于诱变性测验的菌株，使用鼠伤寒沙门氏菌菌株(TA98，TA100和TA104)。而且，一旦需要相同菌株也可用于″经典的″埃姆斯测验法。在所有菌株中，利用recN启动子启动区突变构建体(recN 2-4)给出的测验结果最好。此外，由于所有的沙门氏菌菌株给出相近的结果，已建议只进一步使用TA104构建体(称为TA 104(recN2-4))，因其有时比其它杂交菌株表现更灵敏(Vander Lelie等人，1997)。然而，某些化合物可直接作用于光的产生(如醛类、有机溶剂)，或增强细菌代谢造成假阳性的结果。专利技术目的本专利技术旨在提供一种新的诊断系统和方法，用于检测环境胁迫(environmentol insult)物质，如样品中的基因毒性化合物的存在，这种方法不存在现有技术的种种缺点。本专利技术的主要目的是提供一种新的诊断系统和方法，这种系统和方法去除了假阳性和假阴性的结果。本专利技术的另一个目的在于提供一种诊断系统和方法，其能够用于筛选源于化学的、化妆品的和制药工业领域的基因毒性化合物，作为中间产物或活性化学、化妆品和/或药物化合物的报批前期研究。本专利技术的最后一个目的是提供一种诊断系统和方法，其可对很小体积的样品进行自动筛选。专利技术描述本专利技术涉及的诊断系统包括-一种暴露于环境胁迫物质中便能提高报道基因活性的转化微生物，优选地暴露于基因毒性化合物下。这种微生物含应激可诱导型启动子序列，优选地是基因毒性化合物可诱导型启动子序列。此启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，此核酸序列编码报道分子，报道分子产生可供检测的信号。-一种转化的微生物，其含组成型和非应激诱导型启动子序列，优选地，为不能得到基因毒性化合物诱导的组成型启动子序列，所述启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，该序列编码产生可检测的信号的报道分子。优选的，两种转化微生物是生物发光微生物，可检测的信号是光的产生。其它可用的有过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-gal和gus的遗传序列，因色谱改变或产生化学发光，其信号可利用比色分析仪或光电倍增器来检测。有利地，根据此专利技术的诊断系统由两种转化的生物发光微生物组成，第一种生物发光微生物在基因毒性化合物存在时是“激活的”，产生可供检测的光信号；相反，另一种生物发光微生物中，光的产生不受样品中基因毒性化合物存在的影响。编码报道分子的核酸序列产生可检测的光信号，这在本领域已早有描述。优选的，根据本专利技术的转化的生物发光微生物含有萤光素酶A和B基因，也被确认为表达性的lux基因复合体，其含有luxA和luxB基因或翻译性luxAB融合基因。转化的生物发光微生物也可包含萤光素酶C，D和E基因，这些基因是产生用于循环的有限脂肪酸底物所必需的。根据本专利技术的优选实施方案，诊断系统含有具组成型及非应激诱导型启动子序列的转化微生物，此启动子序列含有σ70共有序列(TTGACA(-35)17/18bp-----TATAAT(-10))，其转录不受启动子水平的正负调节。Hoopes BC和Mcclure WR(1987)描述了此启动子共有序列转录启始的调控策略；《大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞和分子生物学》FCNeidhart，J L Ingraham，K B Low，B maganasik，M Schaechter，H E Umbaeger(编)，美国微生物学会，华盛顿D.C.，1231-1240。根据本专利技术的优选实施方案，转化的生物发光微生物选自大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌，尤其适用于埃姆斯测验法，优选地选自TA98、TA100、TA102、TA104、TA1535、TA1538、TA7001到TA7006和TA7041到TA7046，和/或具有保藏号为LMG P-18318的微生物。保藏号为LMGP-18318的微生物在下文中称为“pr1”菌株。有利地，根据本专利技术的诊断系统中转化的生物发光微生物的应激可诱导型启动子序列选自groEL、dnaK、grpE、phoA、glnA、lon、lysU、rpoD、clpB、clpP、uspA、katG、uvrA、frdA、micF、fabA、lac、his、sodA、sodB、soi-28、recA、xthA、narG、recF、recJ、recN、recO、recQ、ruv、uvrD、ars、cad、mer、pco和sfiA。根据本专利技术的一个优选实施方案，应激诱导型启动子序列是recN，有利地为recN2-4。此微生物下文称为“recN2-4”菌株。在一个优选实施方案中，根据本专利技术的诊断系统包含一种具有应激可诱导型启动子序列的转化生物发光微生物，此序列是SOS调节子的启动子序列，其优选地具有高于40的诱导比率，并有利地含一个增强启动子强度或调控的突变，该突变不会损害SOS调控。突变的recN启动子序列的一个特定例子在国际专利申请PCT/EP96/01745中有描述，在此引用作为参考。所述应激可诱导型启动子序列还含有一个启动子启动区突变，优选的启动子启动区突变位于此启动子-35区，描述于国际专利申请PCT/EP96/01745，在此引用作为参考。本专利技术也涉及诊断试剂盒，此试剂盒包含根据本专利技术的诊断系统的各个元件，而且可能的话，还含有一些必须的附加反应试剂、稀释剂和/或这种诊断用固体支持物，如一种缓冲液，溶液中含特殊标记物如X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)用于使用β-gal遗传序列的诊断，或如鲁米诺用于使用过氧化物酶遗传序列的诊断，等等。本专利技术也涉及诊断环境应激或胁迫物质的一般方法，优选地用于检测样品中基因毒性化合物的存在。所述方法含有将根据本专利技术的诊断系统暴露于所述的环境胁迫物质中的步骤(优选地包括将诊断系统与样品中存在的基因毒性化合物接触的步骤)，以测定该诊断系统信号改变，优选地为发光的改变。本专利技术也涉及基于上述方法测定样品中化合物的基因毒性动力学的方法，其中在不同时间点优选为连续测定可诱导型和组成型的两种转化微生物的发光性，且此外在所述点和时间测定转化微生物的信噪比(S/N)的步骤，再以可诱导型微生物的S/N比除以组成型微生物的S/N比，然后将这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诊断系统，包括： －－一种接触环境胁迫物质便可增加报道基因活性的转化微生物，所述微生物含应激可诱导型启动子序列，启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，该核酸序列编码一种产生可供检测的信号的报道分子，以及 －－一种含组成型和非应激诱导型启动子序列的转化微生物，启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，该核酸序列编码一种产生可供检测的信号的报道分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D范德勒里，LALJB雷尼尔斯，S塔割哈威，PGG科比斯尔，LPE威萨维，
申请(专利权)人：佛兰芒技术研究所，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]