降解毒性化合物的方法技术

本发明专利技术涉及降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和／或合成的拟除虫菊酯杀虫剂的细菌、细菌提取物、得自所述细菌的培养物的上清、多肽及组合物。特别地，本发明专利技术涉及诺卡氏菌的鉴别，其降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和／或合成的拟除虫菊酯杀虫剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细菌、细菌提取物、得自所述细菌培养物的上清、多肽和组合物，它们 用于降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯(carbanilate)杀真菌剂、磺酰胺 除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫剂。特别地，本专利技术涉及诺卡氏菌的 鉴别，其降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代 酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫剂。
技术介绍
化学杀虫剂已经成为现代农业中控制昆虫、植物和真菌有害生物必不可少之物。 据估计在1999年世界范围内应用于农作物的杀虫剂有4百万吨之多。在2004年，全球杀 虫剂销售额达到大约US$330亿。然而，由于滥用、径流和淋洗作用，绝大多数活性成分未达 到靶有害物，而是进入地下水与河流中。因此，杀虫剂污染的有害作用是公众关注的问题， 因为其对于环境和人体健康均有影响。因此需要净化杀虫剂残留物的技术。修复毒性化合 物的传统方法包括焚烧、掩埋或者化学降解(氧化、还原和水解)通常太昂贵，或者对于清 除杀虫剂残留物是不实用的，但是这些问题可以通过生物修复(bioremediation)改善，这 是通过利用生物制剂和方法去除环境污染物的方法。生物修复已经有效地用于清除灌溉尾 水、地下水和土壤中的杀虫剂。活微生物直接应用于污染土壤已经用于降解许多杀虫剂。另一种微生物修复方 法是使用称作酶生物修复的相对新的技术。其特别适于不利于微生物生长或的环境或者 需要快速修复的情况。这种方法包括灌溉径流水、溢流(spill)、日用品清理(commodity clean-up)、冲洗农用机械以及对于农业工人的个人防护。基于酶的生物修复通常利用作为 催化蛋白质来源的杀虫剂抗性微生物、昆虫或者野草的降解能力。典型地，一旦分离具有希 望的降解性质的生物体，则使用基因技术克隆负责基因。确定所得基因产物的酶性质，且如 果需要则使用现代分子生物学技术改善该性质。然后大量生产这些酶并直接用于受影响的 区域，如田地或排出水，以降低杀虫剂含量以及因此降低其毒性。这种技术目前用于清除农 业废水中的杀虫剂残留物。氨基甲酸酯杀虫剂衍生自氨基甲酸(HOOC-NH2),具有图IA所示一般结构。杀虫 剂的化学侧链主要决定其生物学活性。由X表示的原子是氧或硫，而R1和R2可以是许多 不同的有机侧链，通常是甲基或者氢。R3通常是大芳基或者肟部分。苯并咪唑氨基甲酸酯 杀真菌齐U包括苯菌灵(benomyl)、多菌灵(carbendazim)、青菌灵(cypendazole)、咪菌威 (debacarb)禾口 mecarbinzid。早先的研究提供了微生物在“侵蚀性”(aggressive) 土壤中增强氨基甲酸酯降解 中起作用，所述土壤由于反复使用杀虫剂而导致这些化合物的持久性显著降低(Karns et al.，1986 ；Derbyshire et al.，1987 ；Karns et al.，1991 ；Tomasek et al.，1989)。已经揭 示氨基甲酸酯降解过程中最初的步骤通常是氨基甲酸酯键的水解(Topp et al.，1993)。这 个简单的反应主要是辅因子非依赖性过程，因此有利于考虑用于生物修复作用的酶。与降 解相关的一些氨基甲酸酯水解酶已经分离自各种生物体。已经示出降解氨基甲酸酯的酶例6如包括 MCD (Tomasek et al. ,1989)、cahA (Hayatsu et al. ,2001)、cehA (Bornscheuer et al.，2002)和 PCD(Genbank Accession No. M94965)。已经报道了真菌和细菌在增强和非增强土壤中多菌灵(carbendazim)及其它苯 并咪唑化合物的生物降解中的作用(Yarden et al.，1990)。此外，已经描述了两种多菌灵 (carbendazim) P華角军胃—Ralstonia sp.1—1 禾口尺hodococcus sp. Dj 1-6 (Zhang et al.， 2005 Jing-Liang et al.，2006)。然而，目前还没有与多菌灵(carbendazim)水解活性相 关的基因-酶系统。因此需要可用于生物修复例如污染了毒性化合物的土壤、食品和水样的方法和 酶，包括降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代 酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫剂。专利技术概述本专利技术人鉴别了降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺 酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫剂的细菌。因此，在本专利技术的第一方面，提供了降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲 酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫剂的组合物， 所述组合物包含诺卡氏菌、其提取物或者得自其培养物的上清，其降解苯并咪唑氨基甲酸 酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合成的拟除虫 菊酯杀虫剂。可以使用本专利技术的组合物降解的苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂的实例包括但不 限于苯菌灵(benomyl)、多菌灵(carbendazim)、青菌灵(cypendazole)、咪菌威(debacarb) 和mecarbinzid。在特别优选的实施方案中，苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂是多菌灵 (carbendazim)0可以使用本专利技术的组合物降解的苯氨基甲酸酯杀真菌剂的一个实例是乙霉威 (diethofencarb)0可以使用本专利技术的组合物降解的磺酰胺除草剂的实例包括但不限于磺草灵 (asulam)、carbasulam、fenasulam、氛石黄乐灵(oryzalin)、penoxsulam 禾口 pyroxsulam。可以使用本专利技术的组合物降解的硫代酰胺除草剂的实例包括但不限于 bencarbazone 禾口草克乐(chlorthiamid)。可以使用本专利技术的组合物降解的合成的拟除虫菊酯杀虫剂的实例包括但不限于 苄氯菊脂、氰戊菊酯、顺式氰戊菊酯、氯氰菊酯、α “氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氟胺氰 菊酯、氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氟丙菊酯、四溴菊酯、乙氰菊酯、λ -氯氟氰菊酯、七氟菊酯、联 苯菊酯、四氟菊酯、氯氰菊酯和苄螨醚。在优选的实施方案中，合成的拟除虫菊酯杀虫 剂是 mCNMP 1 (R)顺式-α (S)、mCNMP 1 (S)反式-α (S)或者 mCNMP 1 (R)反式-α (R)。在优选的实施方案中，所述诺卡氏菌包含SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或者与其 具有至少99%、更优选至少99. 5%相同性的序列。在另一优选的实施方案中，所述诺卡氏菌、其提取物或者得自其培养物的上清包 含含有如下序列的多肽i) SEQ ID NO 1所示氨基酸序列，或者ii)与SEQ ID NO 1具有至少41%相同性的氨基酸序列。7在另一实施方案中，所述多肽包含i) SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 6所示氨基酸序列，或者ii)与SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6具有至少50%相同性的氨基酸序列。优选地，所述多肽的分子量为大约26kDa。在另一优选的实施方案中，对于多菌灵(carbendazim)，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】AU 2007-6-29 2007903522;US 2007-6-29 60/947,147一种组合物，其用于降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫剂，所述组合物包含诺卡氏菌(Nocardioides sp.)、其提取物或者得自其培养物的上清，所述组合物降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫剂。2.权利要求1的组合物，其中所述苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂是多菌灵 (carbendazim)03.权利要求1或2的组合物，其中诺卡氏菌包含SEQID NO :4所示核苷酸序列或者与 其至少99%相同的序列。4.权利要求1-3任一项的组合物，其中诺卡氏菌、其提取物或者得自其培养物的上清 包含含有如下序列的多肽i)SEQID NO :1所示氨基酸序列，或者ii)与SEQID NO :1至少41%相同的氨基酸序列。5.权利要求1-4任一项的组合物，其中诺卡氏菌是菌株SG-4G，于2007年6月20日保 H^ii^^jM National Measurement Institute，V07/015486。6.权利要求5的组合物，其包含或者由诺卡氏菌SG-4G的辐射杀死的冻干培养物组成。7.分离的诺卡氏菌菌株，其降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌 剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫剂。8.权利要求7的分离的菌株，其中诺卡氏菌是菌株SG-4G，其于2007年6月20日保藏 iil^^JM National Measurement Institute，V07/015486。9.权利要求7或8的分离的菌株，其是死亡的。10.权利要求7-9任一项的分离的菌株的提取物，其降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌 剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合成的拟除虫菊酯杀虫 剂。11.得自权利要求7-9任一项的分离的菌株的培养物的上清或其级分，其降解苯并咪 唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂、硫代酰胺除草剂和/或合 成的拟除虫菊酯杀虫剂。12.基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQID NO :1所示氨基酸序列，其生物 活性片段，或者与SEQ ID NO :1至少41%相同的氨基酸序列的氨基酸，其中所述多肽降解 苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂和/或硫代酰胺除 草剂。13.权利要求12的多肽，其中所述苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂是多菌灵 (carbendazim)。14.权利要求12或13的多肽，其包含与SEQID NO=I至少95%相同的氨基酸序列。15.权利要求12-14任一项的多肽，其中所述多肽可以纯化自诺卡氏菌。16.权利要求15的多肽，其中诺卡氏菌是于2007年6月20日保藏在澳大利亚National Measurement Institute,保藏号 V07/015486。17.权利要求12-16任一项的多肽，其是进一步包含至少一个其它多肽序列的融合蛋白。218.分离的和/或外源的多核苷酸，其包含i)SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列， )编码权利要求12-17任一项的多肽的核苷酸序列，iii)与i)至少41%相同的核苷酸序列，iv)与i)在严格条件下杂交的核苷酸序列，和/或ν)与i)_iv)任一序列互补的核苷酸序列。19.权利要求18的多核苷酸，其与能指导所述多核苷酸在细胞中表达的启动子可操作 地连接。20.包含权利要求18或19的多核苷酸的载体。21.包含权利要求18或19的多核苷酸和/或权利要求20的载体的宿主细胞。22.权利要求21的宿主细胞，其是细菌细胞。23.产生权利要求12-17任一项的多肽的方法，所述方法包括在使得编码所述多肽的 多核苷酸表达的条件下培养编码所述多肽的权利要求21或22的宿主细胞或者编码所述多 肽的权利要求20的载体，以及回收表达的多肽。24.使用权利要求23的方法产生的多肽。25.降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂和/或 硫代酰胺除草剂的聚合海绵或泡沫，所述泡沫或海绵包含固定在聚合多孔支持物上的权利 要求12-17任一项的多肽。26.转基因植物，其包含编码权利要求12-17任一项的至少一种多肽的外源多核苷酸。27.权利要求26的转基因植物，其中所述多核苷酸被稳定掺入所述植物的基因组中。28.转基因非人动物，其包含编码权利要求12-17任一项的至少一种多肽的外源多核 苷酸。29.权利要求21或22的宿主细胞、权利要求26或27的转基因植物、权利要求28的转 基因非人动物的提取物，其中所述提取物包含权利要求12-17任一项的多肽。30.降解苯并咪唑氨基甲酸酯杀真菌剂、苯氨基甲酸酯杀真菌剂、磺酰胺除草剂和/或 硫代酰胺除草剂的组合物，所述组合物包含权利要求12-17任一项的多肽、权利要求18或 19的多核苷酸、权利要求20的载体、权利要求21或22的宿主细胞、得自权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：G潘迪，CM科潘，SJ德里安，R鲁赛尔，J奥克肖特，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，
类型：发明
国别省市：AU