一株嗜碱性芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株嗜碱性芽孢杆菌及其应用，该嗜碱性芽孢杆菌LS‑04为野生菌，活力旺盛，生长速度快；可以发酵产生碱性淀粉酶、碱性木聚糖酶、碱性果胶酶或碱性纤维素酶，具有发酵时间短和酶系丰富的特点；生产的上述碱性水解酶可以被应用于洗涤、纺织和造纸等方面。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物构建筛选
，具体涉及一株嗜碱性芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
碱性酶制剂是指一类可以在碱性环境中发挥较高催化活力的酶制剂，在现代工业应用领域，尤其在碱性处理过程中的应用极为广泛，在全球酶制剂市场中占有非常重要的地位，尤其是在洗涤、造纸、皮革、食品和纺织用酶中占有非常重要的地位，如碱性果胶酶、碱性脂肪酶、碱性淀粉酶、碱性蛋白酶、碱性木聚糖酶和碱性纤维素酶等。碱性酶制剂的研究及其品种的更新和应用拓展在很大程度上得益于对嗜碱微生物资源的深度开发和利用。嗜碱性微生物按其最适生长pH范围可以分为耐碱菌(最适生长pH在9.0以下)和嗜碱菌(最适生长pH在9.0以上)，其中在pH7.0条件下不能生长的微生物又称为专性嗜碱菌，如果可以生长则分类为兼性嗜碱菌。嗜碱菌作为一种极端微生物，是一类重要的工业微生物资源。该类微生物可以在碱性的生理条件下生存并繁殖，由该类微生物分泌的酶类通常具有耐碱性特征并在pH较高的碱性条件下可以发挥较大的催化活力，是碱性酶制剂重要的生产菌株或基因供体。因此，从自然界筛选分离碱性微生物资源并利用该类资源开发具有工业应用价值的新型酶制剂碱性酶制剂开发和利用的一条重要途径。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提出一株嗜碱性芽孢杆菌及其应用，利用本专利技术的嗜碱性芽孢杆菌可以生产碱性酶制剂，可以被应用于洗涤、纺织和造纸等方面。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一株嗜碱性芽孢杆菌，保藏编号为CGMCCNo.11899，为碱性芽孢杆菌并命名为：Bacillussp.LS-04，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2015年12月22日，保藏地点为中国科学院微生物研究所。所述的嗜碱性芽孢杆菌是从芜湖市神山附近土壤中经过筛选得到。该菌株在碱性基础培养基平板上培养24h后显示该菌株菌落呈米白色，表面湿润、不规则、有光泽，产粘性物质不明显。革兰氏染色及显微形态观察结果显示该菌株为革兰氏阳性细菌，细胞为杆状，直径约0.5～1μm长约3～6μm。该菌株的帅选方法为：1、平板初筛使用无菌水对采集的土样进行打碎混匀后进行10-1、10-2和10-3等梯度稀释，分别取0.1mL梯度稀释液涂布于无菌的固体筛选培养基(每L培养基含有：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，KH2PO41g，琼脂20g，使用Na2CO3调节pH至9.5)平板。将涂布后的平板放置于37℃恒温培养箱中培养12h，挑取单菌落划线新平板培养并使用超低温(-80℃)甘油冻结管保藏法分别保藏所得菌株。2、平板复筛将筛选获得的碱性细菌分别点种淀粉培养基(每L培养基含有：可溶性淀粉5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，KH2PO41g，琼脂20g，使用Na2CO3调节pH至9.5)、木聚糖培养基(每L培养基含有：木聚糖10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，KH2PO41g，琼脂20g，使用Na2CO3调节pH至9.5)、纤维素培养基(每L培养基含有：羧甲基纤维素钠5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，KH2PO41g，琼脂20g，使用Na2CO3调节pH至9.5)和果胶培养基(每L培养基含有：果胶3g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，KH2PO41g，琼脂20g，使用Na2CO3调节pH至9.5)，培养20h后分别使用卢戈氏碘液染色，观察透明圈。3、菌种鉴定经上述方法对自然样本进行反复筛选和比较，最终获得一株可以同时分泌碱性淀粉酶、碱性木聚糖酶、碱性纤维素酶和碱性果胶酶的菌株，经显微形态观察(图1)和分子生物鉴定(图2)将该菌株鉴定为碱性芽孢杆菌。碱性芽孢杆菌LS-04分子生物学鉴定：具体包括：碱性芽孢杆菌染色体提取使用SDS抽提法，具体步骤如下：①把分离到的菌种接种到液体培养基中(每L培养基含有：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，KH2PO41g，使用Na2CO3调节pH至9.5)中培养12h，取3mL培养液离心收集菌体，并使用无菌水洗涤一次后再用0.25mL无菌水悬浮；②加入0.25mL20mg/mL溶菌酶溶液，置于37℃水浴中放置30min后取出；③加入55μL10％SDS溶液，充分混匀后在65℃水浴中保温60min，每5min轻柔混匀一次，至溶液通明澄清后取出并冷却至室温；④加入等体积的酚：氯仿，轻柔混匀1min，10000rpm，4℃离心5min，收集上清液；⑤往上清液中加入等体积的氯仿抽提，轻柔混匀，10,000rpm，4℃离心5min，收集上清液；⑥往上清液中加入2倍体积的无水乙醇，室温沉淀20min后，10000rpm，4℃离心10min，收集核酸沉淀；⑦加入1mL75％乙醇洗涤沉淀，10000rpm，4℃离心5min；⑧吸去上清，将离心管倒扣于干净的纸巾上，室温干燥DNA沉淀15min。加入50μL双蒸水，置于4℃备用。碱性芽孢杆菌16SrDNA基因PCR扩增和序列测定以SDS抽提法获得的染色体DNA为模板，以16SrDNA区域通用引物27F(5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ˊ)和1429R(5ˊ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ˊ)为扩增引物，使用PCR方法获得菌株16SrDNA基因片段。PCR扩增体系(50μl)如下将PCR产物连接载体pUCm-T，并转化EscherichiacoliDH5α感受态细胞，抽提重组质粒并委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成目的基因的序列测定，测定的16SrDNA基因序列为SEQIDNO.1。系统进化树构建将菌株的16SrDNA基因片段测序结果通过在线数据库Blast/blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)对测定序列进行比对，选取相近序列并使用BioEdit软件进行多重比对，比对结果通过软件MEGA5.1利用Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树，结合形态学观察结果和碱性生长条件将该分离菌株鉴定为碱性芽孢杆菌。4、菌种生长特性如图3～5所示，该碱性芽孢杆菌LS-04在20～45℃和pH8.5～10.5范围内具有良好的生长能力，其中最适生长温度为40℃，最适生长pH为9.5。所述嗜碱性芽孢杆菌在生产碱性酶制剂中的应用。所述碱性酶制剂包括碱性淀粉酶、碱性木聚糖酶、碱性纤维素酶和碱性果胶酶。以碱性芽孢杆菌LS-04菌株出发，经种子培养和液态发酵过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株嗜碱性芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.11899。

【技术特征摘要】
1.一株嗜碱性芽孢杆菌，保藏编号为CGMCCNo.11899。
2.一种权利要求1所述嗜碱性芽孢杆菌在生产碱性酶制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述嗜碱性芽孢杆菌在生产碱性酶制剂中的应用，其特征在于：所述
碱性酶制剂包括碱性淀粉酶、碱性木聚糖酶、碱性纤维素酶和碱性果胶酶。
4.一种采用权利要求1所述嗜碱性芽孢杆菌生产碱性酶制剂的方法，包括如下步骤：
A、将嗜碱性芽孢杆菌在种子培养基中培养以制备种子培养液；
B、将种子培养液接种液态...

【专利技术属性】
技术研发人员：李松，汤斌，杨倩，刘宇，田方源，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34