一株无毒蜡样芽孢杆菌株pBC-1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种无毒蜡样芽孢杆菌株pBC-1，于2014年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号CGMCC No.9535，经鉴定，其序列为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。本发明专利技术所述的菌株pBC-1，从基因、蛋白及细胞水平的分析表明，该菌株不产生呕吐毒素（cereulide），溶血素BL（Hbl），非溶血性肠毒素（Nhe）和细胞毒素K（CytK）中任何一种毒素。该菌株具有广阔的应用潜力，不仅可以作为益生菌候选菌株应用于医药保健、饲料添加剂或生物兽药，还可以用于清除水体污染和制备、纯化工业用酶类。

【技术实现步骤摘要】
一株无毒蜡样芽孢杆菌株pBC-1及其应用
本专利技术属于微生态制剂领域，具体涉及一株无毒蜡样芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
微生态制剂在医药保健、农业、食品加工、饲料工业和环境保护等多个领域拥有广泛的潜在应用，在蓬勃发展的生物产业中占有重要份额。安全、高效、稳定的菌株是整个微生态制剂的产业化过程的核心内容。蜡样芽胞杆菌属需氧兼性厌氧的革兰阳性杆菌，芽孢呈椭圆形且能耐高温。可用于治疗腹泻，主要机制是：1)活菌制剂进入肠道后，形成优势菌群，与有害菌争夺营养物质和附着位点，竞争性的抑制有害菌的生长，从而调节胃肠道微生物区系平衡；2)通过微生物代谢产生有机酸，降低肠道内的pH值，杀灭不耐酸的有害菌；3)产生多种功能性代谢物，有利于养分分解、抑制肠内氨等有害物质产生、杀灭潜在的病原菌；4)直接刺激肠道免疫细胞而增加局部免疫抗体，增强机体抗病力。同时，以蜡样芽孢杆菌作为主要益生菌的微生态制剂在进入人体或动物体内，可以分泌大量蛋白酶、淀粉酶及其他代谢产物，促进肠道内容物的消化、吸收。这不仅有助于治疗人类的消化不良等疾病，还可促进动物的饲料转化率，提高料肉比，降低排泄物中的营养物质含量，缩短饲养周期，增加养殖者的收益。在作为生物农药使用时，蜡样芽孢杆菌可以产生多种具有杀虫活性的代谢产物，如具有广谱、高效杀虫活性的营养期杀虫蛋白（vegetativeinsectcidalproteins,VIPs）。该类蛋白质可作用于鳞翅目多种昆虫中肠上皮细胞形成离子通道，杀虫活性达纳克级。此外，很多蜡样芽孢杆菌是多种植物的内生菌，能在其活体内定植形成共生关系，而不对寄主植物产生任何危害，促进植物生长、减少病害虫害，提高植物抵御不良环境的能力并减少化肥使用量。除了抑菌和促进植物生长外，部分蜡样芽孢杆菌还具有抑菌杀虫实现对多种谷类、蔬菜和水果的保护作用。此外，蜡样芽孢杆菌还可以用于治理水污染形式的“富营养化”，其兼性厌氧特性和高效的氮、磷转化能力，可以迅速降低水体中氧气以及氮、磷含量，减少藻类及其他浮游生物的繁殖，从而达到净化水体和保护环境的目的。虽然目前蜡样芽胞杆菌具有上述价值，但由于多种原因，面前市场上销售的蜡样芽胞杆菌微生态制剂至少表达一种以上的细菌毒素，对人类健康和公共卫生构成极大的危害。目前4种公认的蜡样芽胞杆菌毒素包括呕吐毒素（cereulide），溶血素BL（haemolysinBL,Hbl）,非溶血性肠毒素（nonhaemolyticenterotoxin,Nhe）和细胞毒素K（cytotoxinK,CytK）。这些毒素可引起食物中毒，产生腹泻、呕吐、休克、严重的甚至致死等症状。因此，筛选出安全有效的蜡样芽胞杆菌至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为筛选出安全有效的蜡样芽胞杆菌，本专利技术从基因、蛋白质和细胞水平上筛选出一株候选菌株pBC-1不表达任何已知的细菌毒素，也不会导致细胞损伤。该菌株繁殖迅速，其他多项评价指标均表现优异，具备作为益生菌的条件。为实现上述目的，本专利技术提供了一种无毒蜡样芽孢杆菌株pBC-1，于2014年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号CGMCCNo.9535，经鉴定，其序列为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）。主要生物学特征为：革兰氏阳性杆菌，需氧或兼性厌氧，菌体两端钝圆，呈链状排列，有鞭毛，能产生芽孢，菌落呈浅灰色、不透明，近似圆形，表面光滑。本专利技术还提供了蜡样芽孢杆菌株pBC-1作为益生菌候选菌株应用于医药保健、饲料添加剂或生物兽药，以及清除水体污染和制备工业用酶类等方面的应用。上述应用通常是以孢子形式制成制剂，但不排除以其他形式的存在制成的制剂。本专利技术还提供了一种以孢子形式制成制剂的方法，具体包括以下步骤：A.血平板培养：将低温保存的蜡样芽孢杆菌菌株pBC-1接种于哥伦比亚羊血琼脂板，于32°C培养24h之后，挑取单菌落重复在哥伦比亚羊血琼脂板培养一次；B.种子液的制备：将步骤A培养的菌种用灭菌的PBS（0.1mM,pH7.2）制成1×108CFU/mL菌悬液，取1mL菌悬液接种量接种于20mL含1%葡萄糖的常规CGY液体培养基中，250转/min，32°C水浴培养6h，获得种子液；C.芽孢的制备：将步骤B中种子液的1%稀释液接种于大豆酪蛋白琼脂培养基中，32°C培养7d，得到蜡样芽孢杆菌pBC-1的芽孢粗提物。D.微生物制剂的制备：将步骤C中得到的芽孢粗提物与辅料混匀，60°C真空干燥，得到蜡样芽孢杆菌干菌粉，血平板培养检验活菌数为1.0×1012CFU/kg。所述的辅料为淀粉、明胶等添加剂。该菌株可用于治疗人体或动物体内细菌感染性腹泻，特别是由耐药菌引起的。蜡样芽胞杆菌pBC-1以孢子形式存在制剂中，在肠道内可生长繁殖，暂时定殖，降低局部氧分子浓度，产生适合肠内正常优势菌群生长的厌氧条件，促进有益菌生长，起到调整肠道菌群失调，恢复肠道微环境，达到治疗或预防的目的。同时，该菌株可以作为益生菌用于动物饲料添加剂。在其进入动物体内，可以分泌大量蛋白酶、淀粉酶及其他代谢产物，促进肠道内容物的消化、吸收。这不仅有助于治疗动物的消化不良等疾病，还可促进动物的饲料转化率，提高料肉比，降低排泄物中的营养物质含量，缩短饲养周期，增加养殖者的收益。此外，该菌株可以作为多种植物的一种内生菌，能在植物活体内定殖形成共生关系，而不对寄主植物产生任何危害，促进植物生长、减少病害虫害，提高植物抵御不良环境的能力并减少化肥使用量。本专利技术的有益效果是：蜡样芽孢杆菌pBC-1菌株在基因水平上呕吐毒素，溶血素BL，细胞毒素K的检测均为阴性，非溶血性肠毒素检测为阳性，但在蛋白水平上该菌株均不表达4种毒素蛋白中任何一种。此外，基于HEp-2和Vero细胞的细胞毒性检测均为阴性。附图说明图1血琼脂培养基上蜡样芽孢杆菌pBC-1的菌落形态。图2蜡样芽孢杆菌pBC-1细菌毒素基因水平的检测。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定，所用试剂若无特别说明，均为市售。实施例1蜡样芽孢杆菌株pBC-1的分离和鉴定在江苏五一农场取土壤5g，溶解在10mL无菌的磷酸盐缓冲液（pH7.2,0.1mM），取0.5mL涂布于商品化的蜡样芽胞杆菌选择性培养基（PEMBA,Thermo），32°C培养18h。挑选阳性菌落在哥伦比亚羊血琼脂板上继续培养，挑取单菌落经表型分析、生化水平鉴定以及16SrRNA序列比对鉴定为蜡样芽胞杆菌，其菌落形态如图1所示，呈浅灰色、不透明，近似圆形，表面光滑。实施例2蜡样芽孢杆菌株pBC-1的培养和毒性检测（1）细菌培养a.酪蛋白水解酵母培养基（CGY）培养基：酪蛋白水解物20g，酵母提取物6g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾14g，磷酸二氢钾6g，柠檬酸钠1g，硫酸镁2g，加水至1L，高压灭菌备用。b.10%葡萄糖溶液：10g葡萄糖溶于100mL蒸馏水，0.22μm滤膜过滤除菌，4°C储存，备用。c.含糖的酪蛋白水解酵母培养基（CGY）配置：酪蛋白水解酵母培养基加入适量10%葡萄糖溶液至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株无毒蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株pBC‑1，其保藏编号为CGMCC No.9535。

【技术特征摘要】
1.一株无毒蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）菌株pBC-1，其保藏编号为CGMCCNo.9535。2.根据权利要求1所述的无毒蜡样芽孢杆菌菌株pBC-1，其特征在于，所述菌株pBC-1不产生呕吐毒素（cereulide），溶血素BL（Hbl），非溶血性肠毒素（Nhe）和细胞毒素K（CytK）中任何一种毒素。3.权利要求1所述的无毒蜡样芽孢杆菌菌株pBC-1在制备制剂中的应用。4.权利要求1所述的无毒蜡样芽孢杆菌菌株pBC-1在制备饲料添加剂中的应用。5.权利要求1所述的无毒蜡样芽孢杆菌菌株pBC-1在制备生物农药中的应用。6.权利要求3-4任一项所述的应用，其特征在于，所述无毒蜡样芽孢杆菌菌株pBC-1是以孢子形式制成制剂。7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制剂制备方法具体如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱奎，
申请(专利权)人：朱奎，
类型：发明
国别省市：江苏;32