【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及病毒疫苗组合物的领域。特别地，本专利技术涉及乙型脑炎疫苗组合物以及制备抵抗乙型脑炎感染的疫苗组合物的过程或方法。本专利技术涉及用于生产和纯化病毒原液(virusbulk)的方法及其所述乙型脑炎病毒原液的灭活技术。专利技术背景乙型脑炎病毒(JEV)是蚊传感染，是整个亚洲病毒性脑炎的主要原因，并越过其大陆界限进行传播。JEV被归类为黄病毒科(flavivirusfamily)和黄病毒属(genusflavivirus)。它是包含10.9kb单链、反义RNA基因组的小包膜病毒(50nm)。病毒体RNA编码包括四种结构蛋白和七种非结构蛋白的11种蛋白。在4种结构蛋白之中，表面包膜蛋白(E蛋白)作为细胞受体结合蛋白和融合蛋白，用于病毒附着并进入宿主中。所以抗体抵抗E蛋白中和病毒，并在保护中发挥重要作用。表面结构E蛋白是疫苗的重要组分，因此它对于用合适的疫苗效力稳定剂稳定该蛋白分子是非常重要的。由于疫苗的广大区域分布和环境温度的差异，存在改进制备乙型脑炎病毒原液的生物过程用于制备生产用微生物并进一步利用疫苗的需求。乙型脑炎的生物过程包括在滚瓶烧瓶或细胞工厂单位中生长。通过滚瓶细胞培养或通过细胞工厂生产工业量的乙型脑炎疫苗需要较大量的时间，产量相对较少，并且还占用大量空间，这使得在每个细胞工厂中时常并经常难以控制和调节实验参数。病毒原液的生产因此固有地缺乏操作的均一性。本专利技术通过其新的
【技术保护点】
一种用于预防由乙型脑炎病毒的印度科拉尔毒株引起的感染的病毒疫苗组合物，所述病毒疫苗组合物包含疫苗抗原，其中所述疫苗抗原是灭活的乙型脑炎病毒的科拉尔毒株，所述乙型脑炎病毒的科拉尔毒株适应于在一次性生物反应器中生长的Vero细胞以收获活乙型脑炎病毒原液。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.14 IN 4135/CHE/20131.一种用于预防由乙型脑炎病毒的印度科拉尔毒株引起的感染的病
毒疫苗组合物，所述病毒疫苗组合物包含疫苗抗原，其中所述疫苗抗原是
灭活的乙型脑炎病毒的科拉尔毒株，所述乙型脑炎病毒的科拉尔毒株适应
于在一次性生物反应器中生长的Vero细胞以收获活乙型脑炎病毒原液。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗抗原生长在所述
一次性生物反应器中的Vero细胞中以收集活乙型脑炎病毒原液，且所述病
毒原液从Vero细胞的单次培养和所述乙型脑炎病毒的科拉尔毒株的单次
感染收获多次(多次病毒收获)，从至少多于一次直至五次或至少三次。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述一次性生物反应器在
以下条件下被保持：50ppm-70ppm的范围内的溶解氧、在35.5℃至37.5℃
之间的温度范围、在7.2至7.6的保持的pH、伴随260rpm至280rpm的
搅拌、80-150ml/min的流入速率和84-156ml/min的流出速率。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所获得的多次的病毒收获
物被进一步纯化和灭活，包括以下步骤：
(a)将病毒收获物用0.45μ膜净化，以将细胞碎片从所述病毒收获物去
除；
(b)将收获物体积用300kDa膜盒浓缩至少4倍，以获得浓缩的存留物；
(c)使步骤(b)的所浓缩的收获物存留物通过celufine硫酸酯基质纯化，
以收集包含期望的病毒、高量的盐细胞蛋白和核酸物质的洗脱物，其中所
述基质由纤维素支持基质在活性基团硫酸酯的存在下组成；
(d)使用300kDa膜盒使步骤(c)的所述洗脱物相对磷酸盐缓冲盐水进行
渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以收集存留物，并将不期望的高量的盐细
胞蛋白和核酸物质从感兴趣的病毒去除，以收集纯化的浓缩的病毒原液；
(e)使步骤(d)的所述纯化的浓缩的病毒原液经受0.45μ膜过滤，以消除
过程中的任何污染物；
(f)将步骤(e)的纯化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福
尔马林(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在22℃持
续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇
组成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的β-丙内酯(即1体积福
尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在5℃±3℃持续7天的时间段来
同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成；
(g)仅在福尔马林灭活的情况中，使用300kDa膜盒使步骤(f)的灭活的
纯化的病毒原液相对磷酸盐缓冲盐水进行渗滤和缓冲液交换至少5-6次，
以去除福尔马林；
(h)将步骤(g)的纯化的灭活的病毒原液用0.22μ膜过滤，以获得在5℃
±3℃持续至少24个月至36个月不含任何污染物、适合于配制乙型脑炎
疫苗的最终且稳定的灭活的JEV原液。
5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所获得的多次的病毒收获
物被进一步纯化和灭活，包括以下步骤：
(a)将病毒收获物用0.45μ膜净化，以将细胞碎片从所述病毒收获物去
除；
(b)通过组合的尺寸排阻和亲和层析术利用CaptoCore-700基质来纯
化，以获得包含纯化的病毒的流出物，其中所述基质由高度交联的琼脂糖
基质与官能活性配体辛胺基团组成；
(c)将步骤(b)的所述流出物使用300kDa膜盒来浓缩和渗滤，以获得纯
化的浓缩的病毒原液；
(d)使步骤(c)的所述纯化的浓缩的病毒原液经受0.45μ膜过滤，以消除
过程中的任何污染物；
(e)将步骤(d)的纯化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福
尔马林(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在22℃持
续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇
组成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的β-丙内酯(即1体积福
尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在5℃±3℃持续7天的时间段来
\t同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成；
(f)仅在福尔马林灭活的情况中，使用300kDa膜盒使步骤(e)的灭活的
纯化的病毒原液相对磷酸盐缓冲盐水渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以去
除福尔马林；
(g)将步骤(f)的纯化的灭活的病毒原液用0.22μ膜过滤，以获得在5℃
±3℃持续至少24个月至36个月不含任何污染物、适合于配制乙型脑炎
疫苗的最终且稳定的灭活的JEV原液。
6.一种使乙型脑炎病毒的科拉尔毒株在能够在一次性生物反应器中
工业化生产的Vero细胞中适应以收集活乙型脑炎病毒原液的方法，且所述
病毒原液从Vero细胞的单次培养和所述乙型脑炎病毒的科拉尔毒株的单
次感染收获多次(多次病毒收获)，从至少多...
【专利技术属性】
技术研发人员：克里什纳·莫汉·瓦德雷夫，文卡特桑·拉马沙米，普拉桑纳·库马尔·杜夫鲁，
申请(专利权)人：巴拉特生物技术国际有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN
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