细菌疫苗及其制备方法技术

公开了用于针对伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的保护的稳定的缀合物疫苗制剂，以及将伤寒沙门氏菌的Vi‑多糖缀合至作为载体蛋白的破伤风类毒素的方法，所述缀合导致产生改善的抵抗由伤寒沙门氏菌引起的伤寒症的T‑依赖性免疫应答。在本发明专利技术中公开的方法以及得到的制剂能够通过构成完整的疫苗接种时间表的仅单次注射引起抵抗伤寒症的免疫，包括在小于2岁的儿童中。

【技术实现步骤摘要】
细菌疫苗及其制备方法本申请是申请日为2014年8月19日，申请号为201480057921X，专利技术/名称为“细菌疫苗及其制备方法”的申请的分案申请。专利
本专利技术涉及特征为在婴幼儿、儿童和成年中引起充足的抵抗伤寒症的免疫应答的细菌疫苗的领域。特别地，本专利技术涉及缀合物疫苗及其制备方法，其中伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)的天然多糖被缀合至载体蛋白并被配制为预防性缀合物疫苗。此外，本专利技术还涉及用于针对伤寒沙门氏菌和麻疹病毒的保护的组合疫苗制剂的领域。专利技术背景伤寒沙门氏菌，人类伤寒症的致病细菌，是非洲、亚洲和中东的主要地方性疾病。被伤寒沙门氏菌污染的食物和水被认为是该疾病传播的主要来源。多个研究已经表明，伤寒症的全球负担在世界的不同部分有所不同。在中南亚和东南亚，在100,000人口中每年报道超过100个病例；估计亚洲、非洲、拉丁美洲和加勒比海具有伤寒症的中等发生率，即，在100,000人口中每年10至100个病例；新西兰、澳大利亚和欧洲具有低到非常低的发生率(Crump等人,2004)。这表明，伤寒症在世界的区域内、特别是在具有低的资源配置的发展中国家中具有强的地方性。沙门氏菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，肠杆菌科包括志贺氏菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)和弧菌属(Vibrio)。沙门氏菌属包括两个不同的种，肠道沙门氏菌(S.enterica)和邦戈尔沙门氏菌(S.bongori)。肠道沙门氏菌被进一步分为包括2443个血清型的六个亚种(肠道(enterica)、萨拉姆(salamae)、亚利桑那(arizonae)、双亚利桑那(diarizonae)、豪顿(houtenae)和因迪卡(indica))。因此，引起伤寒症的媒介物是肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型(通常被称为肠道沙门氏菌伤寒血清型)和甲型、乙型和丙型副伤寒血清型。血清变型(serovar)或血清型(serotype)可以被定义为具有负责产生特异性抗体的独特表面分子的菌株。每种血清型在它们的抗原区具有细微的化学差异(Brenner等人，2000)。伤寒沙门氏菌具有使其成为有效病原体的特征组合。该物种含有革兰氏阴性生物体特有的内毒素，以及被认为增加毒力的Vi多糖抗原。它还产生并分泌被称为“侵袭素”的蛋白质，所述蛋白质允许非吞噬细胞摄入该细菌，允许该细菌在细胞内生存。它还能够抑制白细胞的氧化爆发，使先天性免疫应答失效。在近十年期间，已经发现沙门氏菌物种获得越来越多的抗生素抗性。原因似乎是在人类和动物的沙门氏菌病的治疗中增加和随意使用抗生素，以及向饲养的动物(breedinganimal)的食物中添加促进生长的抗生素。质粒携带的抗生素抗性在小儿流行病中涉及的沙门氏菌菌株中非常常见。常观察到对氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮和磺胺类的抗性。尚未观察到粘菌素抗性。应该系统地检查沙门氏菌菌株的抗生素抗性，以当需要时帮助选择有效药物，并检测(来自动物来源或人类来源的)菌株的抗生素敏感性的任何变化。直到1972年，伤寒沙门氏菌菌株还保持着对抗生素的敏感性，所述抗生素包括氯霉素(最常被用来抵抗伤寒的抗生素)；但是在1972年，在墨西哥的广泛流行病由伤寒沙门氏菌的氯霉素抗性菌株引起。自此在印度、泰国和越南分离到了其他的氯霉素抗性菌株。由伤寒沙门氏菌导致的的抵抗伤寒症的疫苗对于由于抗生素抗性增加导致的这些威胁生命的病症是至关重要的。对于人们到具有地方性伤寒症的地区旅行，它也是重要的保护手段。由于细菌具有获得多药物抗性能力的能力，抗生素可能无法提供完全的保护。到现在为止，目前已经制备出了可用于使用的三种类型的伤寒疫苗：(1)胃肠外灭活全细胞疫苗；(2)口服减毒活疫苗；(3)用于胃肠外使用的伤寒-Vi荚膜多糖疫苗。在早期清楚地研究了生物体的细胞和分子的复杂性，设计了抵抗伤寒症的疫苗。最初，通过热-苯酚-灭活法灭活的胃肠外施用的全细胞伤寒沙门氏菌被用作疫苗，以两个剂量施用。由于全细胞灭活的疫苗含有‘O’抗原(内毒素)，所以它们倾向于在接种疫苗的个体内产生局部和全身反应，并且这些类型的疫苗每两年需要加强剂量。口服减毒活Ty21a疫苗被认为是第二代疫苗，所述第二代疫苗使用缺少腺苷酸环化酶和AMP受体蛋白的突变伤寒沙门氏菌菌株以及对对氨基苯甲酸盐/酯和腺嘌呤营养缺陷的突变体制成。这些减毒活疫苗报告出差的效力，并且被发现不适合用于对小于6岁的儿童施用。另外，每5年还需要加强剂量。后来，伤寒沙门氏菌的荚膜Vi-多糖被鉴定为能够在人类中引起充足的免疫应答的保护性免疫原，并因此在常规免疫时间表中被用作潜在的疫苗候选者。注射25μg/0.5mL的剂量的纯化的荚膜Vi-多糖(ViP)能够产生最大的血清转变，即抗体升高至四倍。但是，在许多临床试验中，已经报道了Vi-多糖的局限性，天然多糖疫苗不能或不产生第二免疫应答。该现象是由于细菌多糖实际上是T细胞非依赖性的，并因此不能产生细胞介导的免疫应答。因此为了解决所述问题，进一步缀合伤寒沙门氏菌的多糖和载体蛋白以形成多糖-蛋白分子，以使其成为T细胞依赖性抗原。存在多种影响多糖和蛋白结合的因素，所述结合取决于选择的ViP和载体蛋白的分子量以及官能团的活化。低分子量多糖能够导致与载体蛋白的有效结合。多种载体蛋白像破伤风类毒素、白喉CRM197、大肠杆菌(Escherichiacoli)的热不稳定毒素的B亚基(LT-B)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的重组胞外蛋白A(rEPA)和马蹄rab血蓝蛋白(HorseshoerabHaemocyanin)(HCH)已常被用于缀合。WO1996/011709公开了一种O-乙酰化的寡核苷酸或多半乳糖醛酸酯果胶，其与缀合至载体蛋白破伤风类毒素的Vi多糖亚基结构基本上相同，其中所述载体蛋白是由胱胺衍生而来。该特定专利教导了使用不同的衍生剂(derivatizer)即胱胺将相同的多糖而非Vi-多糖缀合至载体蛋白。后来，WO1998/026799公开了一种来自甲型副伤寒沙门氏菌的分离的脂多糖，所述脂多糖已经通过解毒去除了其脂质A，并保留了其70％至80％的O-乙酰含量，并且然后通过己二酸二酰肼(ADH)缀合至载体蛋白破伤风类毒素。WO2000/033882公开了通过己二酸二酰肼共价结合至铜绿假单胞菌的蛋白的伤寒沙门氏菌的Vi-多糖(Vi-rEPA)缀合物。WO2007/039917公开了共价/非共价结合至热激蛋白的伤寒沙门氏菌的外源性抗原。WO2009/150543描述了一种缀合的Vi-多糖，其被用作抵抗引起伤寒症的伤寒沙门氏菌的疫苗组合物，其中所述Vi-多糖共价缀合至选自CRM197或破伤风类毒素的蛋白质。如在WO2009/150543中公开的缀合方法包括首先在2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES缓冲液)的存在下将载体蛋白(所述载体蛋白优选为CRM197或破伤风类毒素)同时添加至接头(诸如己二酸二酰肼(ADH))以及碳二亚胺(诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于预防由伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)引起的伤寒症的疫苗制剂，所述疫苗制剂包含部分脱O-乙酰化的伤寒沙门氏菌的荚膜Vi-多糖(ViP)，所述荚膜Vi-多糖(ViP)缀合至载体蛋白形成Vi-多糖(ViP)-载体蛋白缀合疫苗抗原，/n其中，所述Vi-多糖(ViP)-载体蛋白缀合疫苗抗原包含活化的部分脱O-乙酰化荚膜Vi-多糖(ViP)，所述活化的部分脱O-乙酰化荚膜Vi-多糖(ViP)与载体蛋白缀合，其中所述载体蛋白没有用ADH衍生化，并且没有游离的ADH附接至所述载体蛋白；/n其中，所述疫苗制剂包含每剂5μg至25μg的所述缀合疫苗抗原；并且/n其中，所述疫苗制剂的单个剂量通过构成完整的疫苗接种时间表的仅一次注射引发所需要的抵抗伤寒沙门氏菌的T依赖性免疫应答，所述引发包括在两岁以下的儿童中引发抵抗伤寒沙门氏菌的T依赖性的免疫应答。/n

【技术特征摘要】
20130824 IN 3750/CHE/20131.一种用于预防由伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)引起的伤寒症的疫苗制剂，所述疫苗制剂包含部分脱O-乙酰化的伤寒沙门氏菌的荚膜Vi-多糖(ViP)，所述荚膜Vi-多糖(ViP)缀合至载体蛋白形成Vi-多糖(ViP)-载体蛋白缀合疫苗抗原，
其中，所述Vi-多糖(ViP)-载体蛋白缀合疫苗抗原包含活化的部分脱O-乙酰化荚膜Vi-多糖(ViP)，所述活化的部分脱O-乙酰化荚膜Vi-多糖(ViP)与载体蛋白缀合，其中所述载体蛋白没有用ADH衍生化，并且没有游离的ADH附接至所述载体蛋白；
其中，所述疫苗制剂包含每剂5μg至25μg的所述缀合疫苗抗原；并且
其中，所述疫苗制剂的单个剂量通过构成完整的疫苗接种时间表的仅一次注射引发所需要的抵抗伤寒沙门氏菌的T依赖性免疫应答，所述引发包括在两岁以下的儿童中引发抵抗伤寒沙门氏菌的T依赖性的免疫应答。


2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述疫苗抗原以每剂25μg的浓度存在于所述疫苗制剂中。


3.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197，优选破伤风类毒素。


4.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述缀合疫苗抗原通过包括以下步骤的方法制备：
a.使用进料培养基进行分批进料模式的培养以获得纯化的Vi-多糖(ViP)，所述进料培养基包括进料包含1mg/mL至2mg/mL浓度范围的葡萄糖的溶液、pH保持在6.90至7.20的范围内并且溶解氧水平保持在40％-60％之间，其中与所述进料培养基一起，供给氨溶液(50％)作为氮源；
b.任选地减小Vi-多糖(ViP)的大小，其中使5-7.5mg/ml的浓度的所述Vi-多糖(ViP)在1500巴、2-8℃经受高压均质化并且重复相同的活动至少45次，或者通过微波炉，以获得大约250kDa的相应分子大小的纯化的Vi-多糖(ViP)；
c.使用交联剂EDAC处理步骤(a)或步骤(b)的所述纯化的Vi-多糖(ViP)；
d.在交联剂EDAC的存在下，以1mg/ml至5mg/ml的～900kDa的纯化的Vi-多糖(ViP)的浓度或以5mg/ml至7.5mg/ml的～250kDa的纯化的Vi-多糖(ViP)的浓度，用步骤(c)的Vi-多糖(ViP)处理载体蛋白，以形成Vi-多糖(ViP)-载体蛋白缀合物；
e.通过使用1000kDa膜与磷酸盐缓冲盐水进行连续的缓冲液交换来渗滤步骤(d)的所述Vi-多糖(ViP)-载体蛋白缀合物，以获得纯化的Vi-多糖(ViP)-载体蛋白疫苗抗原。


5.根据权利要求4所述的疫苗制剂，其中所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197，优选破伤风类毒素。


6.根据权利要求3和权利要求5中任一项所述的疫苗制剂，其中所述载体是破伤风类毒素。


7.一种制备伤寒沙门氏菌Vi-多糖(ViP)-载体蛋白缀合物疫苗抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使用进料培养基进行分批进料模式的培养以获得纯化的Vi-多糖(ViP)，所述进料培养基包括进料包含1mg/mL至2mg/mL浓度范围的葡萄糖的溶液、pH保持在6.90至7.20的范围内并且溶解氧水平保持在40％-60％之间，其中与所述进料培养基一起，供给氨溶液(50％)作为氮源；
b.任选地减小Vi-多糖(ViP)的大小，其中使5-7.5mg/ml的浓度的所述Vi-多糖(ViP)在1500巴、2-8℃经受高压均质化并且重复相同的活动至少45次，或者通过微波炉，以获得大约250kDa的相应分子大小的纯化的Vi-多糖(ViP)...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里希纳·默斯·艾拉，文卡特桑·拉马沙米，曼达拉普·甘加达尔·奈杜，
申请(专利权)人：巴拉特生物技术国际有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN