肠道病毒对VERO细胞的适应及其疫苗制剂制造技术

本发明专利技术公开了适应在Vero细胞中增殖至高滴度的肠道病毒D68及其适应方法。本发明专利技术还公开了包含灭活的肠道病毒D68抗原的合适的疫苗组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肠道病毒对VERO细胞的适应及其疫苗制剂相关专利申请本申请要求于2018年12月29日提交的印度专利申请号201841049814的优先权和权益；其公开内容以引用方式并入本文。专利
本专利技术涉及通过对推荐用于疫苗生产的细胞基质进行适应来创建新病毒毒株并利用新病毒株用于生成疫苗和作为诊断工具。专利技术背景肠道病毒68或肠道病毒D68是新出现的肠道病毒，引起呼吸道疾病，症状轻到严重，常表现为流感样症状和神经系统疾病，如急性弛缓性脊髓炎(AFM)。肠道病毒68是正义单链RNA病毒，属于肠道病毒属和小核糖核酸病毒科(Picobirnaviridae)的D种。虽然第一次分离是在1962年的美国(Schieble等人，AmJEpidemiol1967，85:297-310)，但直到21世纪初，这种病原体才被频繁报道(Oberste等人，JGenVirol2004，85:2577-2584)。此后，全世界都报告了由肠道病毒D68引起的爆发(Eshaghi等人，FrontMicrobiol2017，8:257)。2014年，由于肠道病毒D68扩散至美国各地导致大规模爆发，导致1153人感染，14人死亡(CDC.非脊髓灰质炎肠道病毒：肠道病毒D68；Midgley等人，MMWRMorbVertalWklyRep2014，63:798-9)。同一时期，加拿大报告了肠道病毒感染的激增(Skowronski等人，EuroSurveill，2015年，20:1-14；Edwin等人，CanCommuniDisRep2015，41Suppl1:2-8)。随后，不同国家报告了由肠道病毒D68引起的呼吸道感染(Dyrdak等人，EuroSurveill2016，21；Knoester等人，EmergInfecDis2017，23:140-143；Wang等人，SciRep2017，7:1242)。US20160312314A1公开了一种检测肠道病毒D68的方法，通过将从样品中获得的核酸与寡核苷酸引物接触，将接触的样品暴露于DNA扩增过程中，该过程提供肠道病毒D68VP1基因的98核苷酸扩增产物的产生，并且随后检测该98核苷酸扩增产物，其中所述扩增产物的存在表明样品含有肠道病毒D68。US20160355897A1公开了用于检测样品中肠道病毒D，特别是检测肠道病毒D68的方法和组合物。所述方法包括在足以通过至少一种引物特异性扩增EV-D68VP1核酸的条件下和/或在足以使探针特异性杂交到EV-D68核酸的条件下，将样品与能够特异性扩增EV-D68病毒蛋白1(VP1)核酸或其部分的至少一种引物(例如正向引物和/或反向引物)和/或能够特异性杂交到EV-D68VP1核酸的可检测标记的探针接触。检测EV-D68VP1核酸的扩增和/或探针与EV-D68VP1核酸的杂交，从而鉴定样品中是否存在EV-D68。现有技术未能教导已知的肠道病毒D68在Vero细胞中适应和繁殖，Vero细胞是推荐用于疫苗生产的病毒繁殖的细胞基质。此外，现有技术仅限于检测肠道病毒D病毒株的方法，并且未公开可用作疫苗/免疫原性组合物以提供针对病毒的保护的任何组合物。针对这种可怕的新出现的病毒的疫苗是必要的，但到目前为止还没有。本专利技术公开了使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖的方法。本专利技术还公开了一种含有突变的核酸序列的肠道病毒株，所述突变的核酸序列翻译成作为适于在疫苗组合物中使用的抗原的蛋白质。本专利技术还公开了合适的疫苗组合物。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供一种使肠道病毒D68株(一种或多种)在细胞基质中适应的方法，所述细胞基质是推荐用于疫苗生产的细胞基质(例如Vero细胞)。本专利技术的另一个目的是提供新的肠道病毒D68株(一种或多种)，其适应在Vero细胞上繁殖并且能够在Vero细胞上以高滴度产生。本专利技术的另一个目的是提供针对肠道病毒D68感染的灭活的疫苗制剂，其包含所述病毒株。本专利技术的另一个目的公开了使用适应Vero细胞的肠道病毒D68的重组蛋白或完整肠道病毒D68病毒用于产生针对分别的重组蛋白或完整病毒的抗体，所述抗体可用于诊断分别的抗原。专利技术概述本专利技术的一个方面是提供使肠道病毒D68在推荐用于疫苗生产的细胞基质中适应的方法。在一些实施方案中，提供了适应于在Vero细胞中繁殖到高滴度的肠道病毒D68，其由具有SEQIDNo1的核苷酸序列的cDNA分子编码。在一些其他实施方案中，提供了SEQIDNo2中公开的编码适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的核苷酸序列。在另一实施方案中，提供了SEQIDNo3中公开的适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的氨基酸序列。本专利技术的另一方面是提供适应Vero细胞的肠道病毒D68病毒中的氨基酸水平变化(V341L、E647G、M699K、E719K、D1355N、T1406S、H2110Q)。在一些实施方案中，提供了一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖到高滴度的方法，包括以下步骤：(a)通过在32-35℃，更准确地在32-33℃吸附约60-120分钟来感染病毒；(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃添加维持培养基后繁殖病毒；(c)以1:3至1:10的稀释度稀释从每次传代获得的病毒原液，以感染接下来的Vero细胞批次用于在32-35℃，更准确地在32-33℃进行病毒的初始传代；(d)以1:20-1:500的稀释度稀释病毒以在32-35℃，更准确地在32-33℃在随后/后续的传代中感染Vero细胞；和(e)在每次传代期间达到90％或更高的细胞病变效应时或在感染的6天内收获病毒。在一些其他实施方案中，提供了一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖到高滴度的方法，其中肠道病毒D68病毒进行空斑测定，包括以下步骤：(a)每12孔板或6孔板铺板300万至400万个Vero细胞以达到适合空斑测定的汇合度；(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃，一式两份、一式三份或一式四份地在不同孔中吸附不同稀释度的病毒1-2小时；(c)以≤0.6％的羧甲基纤维素或0.8-1.8％的AvicelRC591作为覆盖介质进行覆盖；(d)用羧甲基纤维素作为覆盖物在感染后5-7天后或用AvicelRC591作为覆盖物在感染后3-4天后，用10％福尔马林固定细胞；(e)在固定后去除固定液并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞；和(f)将新鲜制备的染色液-结晶紫溶液逐滴加到固定的细胞中，并在室温染色30分钟至1小时或2小时。在一些其他实施方案中，提供了一种灭活含有SEQIDNo.1编码的cDNA的肠道病毒D68用于免疫的方法，包括以下步骤：(a)对收获的肠道病毒D68病毒进行无菌过滤；(b)使用核酸酶处理去除宿主核酸并使用100kDa过滤器通过切向流过滤进行浓缩；(c)使用1/2000-1/4000福尔马林在从25-37℃变化的温度多至3周或使用BPL在4-25℃多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肠道病毒D68，其适应于在Vero细胞中繁殖至高滴度，由具有SEQ ID No 1的核苷酸序列的cDNA分子编码。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181229 IN 2018410498141.一种肠道病毒D68，其适应于在Vero细胞中繁殖至高滴度，由具有SEQIDNo1的核苷酸序列的cDNA分子编码。


2.一种核苷酸序列，其编码适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白，所述核苷酸序列在SEQIDNo2中公开。


3.一种适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的氨基酸序列，在SEQIDNo3中公开。


4.一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖至高滴度的方法，包括以下步骤：
(a)通过在32-35℃，更准确地在32-33℃吸附约60-120分钟来感染病毒；
(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃添加维持培养基后繁殖病毒；
(c)以1:3至1:10的稀释度稀释从每次传代获得的病毒原液以感染接下来的Vero细胞批次，用于在32-35℃，更准确地在32-33℃进行病毒的初始传代；
(d)以1:20-1:500的稀释度稀释病毒以在32-35℃，更准确地在32-33℃在随后/后续的传代中感染Vero细胞；和
(e)在每次传代期间达到90％或更高的细胞病变效应时或在感染的6天内收获病毒。


5.权利要求4所述的方法，其中肠道病毒D68病毒进行空斑测定，包括以下步骤：
(a)每12孔板或6孔板铺板300万至400万个Vero细胞以达到适合空斑测定的汇合度；
(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃，一式两份、一式三份或一式四份在不同孔中吸附不同稀释度的病毒1-2小时；
(c)以≤0.6％的羧甲基纤维素或0.8-1.8％的AvicelRC591作为覆盖介质进行覆盖；
(d)用羧甲基纤维素作为覆盖物在感染后5-7天后或用AvicelRC591作为覆盖物在感染后3-4天后，用10％福尔马林固定细胞；
(e)在固定后去除固定液并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞；和
(...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·雷丘杜里，K·M·艾拉，
申请(专利权)人：巴拉特生物技术国际有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN