基于合成的多肽表位的疫苗组合物制造技术

选自手足口病的两种主要病原体EV71和CVA16的保守表位已经被用于开发亚基二价疫苗抗原构建体。本发明专利技术中描述的所述疫苗能够提供针对不同的引起EV71和CVA16感染的毒株的交叉保护。还公开了多表位疫苗抗原编码基因的表达及其所涉及的纯化方法。本发明专利技术还公开了针对手足口病和其他肠道病毒感染的疫苗制剂，所述疫苗制剂包含本发明专利技术的重组疫苗抗原构建体。

Vaccine composition based on synthetic peptide epitopes

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于合成的多肽表位的疫苗组合物专利
本专利技术涉及基于合成的多肽表位的疫苗组合物。更具体地，选自EV71和CVA16的保守表位被用于开发亚基(sub-unit)二价疫苗抗原构建体，并且使用所开发的亚基二价疫苗抗原构建体提供了疫苗组合物，其中该疫苗能够提供针对不同的引起EV71和CVA16感染的毒株的交叉保护。还公开了多表位疫苗抗原编码基因的表达及其所涉及的纯化方法。本专利技术还公开了针对手足口病(HandFootandMouthDisease)和其他肠道病毒感染的疫苗制剂，所述疫苗制剂包含本专利技术的重组疫苗抗原构建体。专利技术背景手足口病(HFMD)是一种常见的儿科疾病，其主要由肠道病毒-71(EV71)和柯萨奇病毒A16(CVA16)引起。它们两者都是单链正义RNA病毒，并且属于小RNA病毒科(Picornaviridae)。EV71还引起范围从无菌性脑膜炎到急性弛缓性麻痹、脑干脑炎以及甚至死亡的许多神经系统并发症。通常这两种病毒共传播并且引起共感染，对许多亚洲国家的医疗系统带来破坏性影响。EV71和CVA16是针对手足口病的两种主要病原体(etiologicalagent)。两种病毒都是高度多态性的，并且针对一种病毒的抗体将不会提供针对另一种病毒的显著交叉保护。因此，针对这两种病毒的可能的二价蛋白组合物极大地有望减轻该疾病的全球负担。熟知的是，大多数中和抗体定位于肠道病毒中的主要衣壳蛋白VP1中。VP1由于频繁的突变和重组事件在不同的毒株中具有很多序列变异性(LeitchECM等人J.Virol.2012；86:2676-2685)。到目前为止，基于VP1序列变异，EV71已经被分类为七个遗传组(genogroup)(GgA-GgG)，并且遗传组B和C被进一步细分为B1-B5和C1-C5(BrownBA等人J.Virol.1999；73:9969-9975)。因此，高度期望开发针对这两种病毒的疫苗，从而限制它们。本专利技术的专利技术人提出并已经在此开发了主要针对EV71和CA16的疫苗，该疫苗具有抵抗其他紧密传播的引起HFMD的血清组的交叉保护的潜力。已经设计并构建了独特的合成基因，所述独特的合成基因编码多拷贝的源自来自肠道病毒-71和柯萨奇病毒-A16的衣壳蛋白(VP1)的表位，以用作具有作为针对由EV71和CA16引起的手足口感染的疫苗候选物进行免疫接种的潜力的独特且高效的重组蛋白构建体。此外，本专利技术人在本专利技术中还开发并公开了另一种疫苗候选物，其涵盖来自EV71和CVA16的主要衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的表位区域。专利技术目的在一个目的中，本专利技术提供了基于合成的多肽表位的疫苗组合物。在另一个目的中，本专利技术提供了使用选自EV71和CVA16的保守表位的重组亚基二价疫苗抗原构建体。在另一个目的中，本专利技术提供了一种疫苗，所述疫苗能够提供针对不同的引起EV71和CVA16感染的毒株的交叉保护。在另一个目的中，本专利技术还提供了多表位疫苗抗原编码基因的表达及其所涉及的纯化方法。在另一个目的中，本专利技术提供了针对手足口病和其他肠道病毒感染的疫苗制剂，所述疫苗制剂包含本专利技术的重组疫苗抗原构建体。专利技术概述根据本专利技术的一个实施方案，公开了针对手足口病的基于多表位的疫苗抗原的示意性结构和密码子优化的基因序列和蛋白序列。根据本专利技术的另一个实施方案，公开了本专利技术的密码子优化的序列在适当的宿主中作为包涵体形式的表达。本专利技术的另外的实施方案描述了蛋白纯化的方法，所述方法包括用裂解缓冲液-I和裂解缓冲液-II裂解，用洗涤缓冲液I、II和III洗涤，固定化金属亲和色谱，随后对感兴趣的蛋白SEQIDNo.2和SEQIDNo.4进行透析并且用适当的重折叠缓冲液重折叠以及回收，随后进行特定的色谱纯化技术诸如尺寸排阻色谱。本专利技术的另外的实施方案还通过适当的动物研究确立了本专利技术的免疫原性。SEQIDNo.2和SEQIDNo.4能够针对由肠道病毒和柯萨奇病毒引起的手足口病产生足够的免疫应答。本专利技术的疫苗抗原还能够诱发针对引起人类手足口病的肠道病毒和柯萨奇病毒的任何毒株的交叉保护。作为本专利技术的实施方案之一，还可以得到包含SEQIDNo.2和SEQIDNo.4以及多种佐剂的特定疫苗制剂，所述疫苗制剂任选地存在其他稳定剂如多元醇、糖或氨基酸或组合。在本专利技术的另一方面，提供了用于预防由EV71和CA16引起的手足口病的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：(a)疫苗抗原，所述疫苗抗原是选自由SEQIDNo.2(被命名为MEV1)和SEQIDNo.4(被命名为MEV2)表示的重组蛋白序列的合成的构建体；(b)佐剂；(c)稳定剂；以及(d)选自磷酸盐和柠檬酸盐的任何生理上可接受的缓冲剂；其中所述疫苗制剂在5±3℃稳定至少2年并且在37℃稳定多达2周。附图简述图1：针对肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16的多表位二价疫苗基因构建体(MEV1和MEV2)。1A：MEV1的示意图示出了四个拷贝的串联存在的三个表位。接头将表位分开以增加柔性。NdeI和BamHI序列分别存在于5'端和3'端。1B：MEV2的示意图示出了三个拷贝的串联存在的六个表位，随后是一个拷贝的另外三个表位。接头将表位分开以增加柔性。NdeI和BamHI序列分别存在于5'端和3'端。图2：评估了不同浓度的IPTG，以估计用于表达MEV1(2A)和MEV2(2B)的最佳浓度。2A：从左侧起，泳道1：未诱导的细胞(不存在IPTG)，泳道2-4：分别用0.2mM、0.5mM和0.75mM的IPTG诱导的细胞，泳道5：蛋白分子量标志物，从底部起尺寸分别为16kDa、29kDa、33kDa、43kDa、54kDa、71kDa、91kDa、124kDa和250kDa，泳道6-8：分别用0.2mM、0.5mM和0.75mM的IPTG进行诱导并且随后进行裂解之后的具有蛋白聚集体的细胞沉淀物，泳道9-11：分别用0.2mM、0.5mM和0.75mM的IPTG进行诱导并且随后进行裂解之后的细胞裂解物。2B：从左侧起，泳道1：未诱导的用pET11b-MEV2转化的BL21(DE3)细胞(不存在IPTG)，泳道2-4：使用0.2mM、0.5mM和0.75mM的IPTG诱导用pET11b-MEV2转化的BL21(DE3)细胞。结论：图中的结果显示出可以使用宽范围的IPTG浓度诱导MEV1和MEV2的表达。图3：在不同的温度环境中评估MEV1(3A、3B)和MEV2(3C)的表达水平。(3A)：-从左侧起，泳道1：未诱导的细胞(不存在IPTG)，泳道2：如图1中描述的蛋白分子量标志物，泳道3-4：分别为在37℃用0.2mMIPTG进行诱导并且随后进行裂解之后的细胞裂解物和细胞沉淀物，泳道4-5：分别为在25℃用0.2mMIPTG进行诱导并且随后进行裂解之后的细胞裂解物和细胞沉淀物。(3B)：-从左侧起，泳道1：未诱导的细胞(不存在IPTG)，泳道2：在37℃用IPT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防由EV71和CA16引起的手足口病，所述疫苗组合物包含：/na.疫苗抗原，所述疫苗抗原是选自由SEQ ID No.2(被命名为MEV1)和SEQ ID No.4(被命名为MEV2)表示的重组蛋白序列的合成的构建体；/nb.佐剂；/nc.稳定剂；以及/nd.选自磷酸盐和柠檬酸盐的生理上可接受的缓冲剂；/n其中所述疫苗制剂在5±3℃稳定至少2年并且在37℃稳定多达2周。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170703 IN 2017410234111.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防由EV71和CA16引起的手足口病，所述疫苗组合物包含：
a.疫苗抗原，所述疫苗抗原是选自由SEQIDNo.2(被命名为MEV1)和SEQIDNo.4(被命名为MEV2)表示的重组蛋白序列的合成的构建体；
b.佐剂；
c.稳定剂；以及
d.选自磷酸盐和柠檬酸盐的生理上可接受的缓冲剂；
其中所述疫苗制剂在5±3℃稳定至少2年并且在37℃稳定多达2周。


2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中具有蛋白SEQID2的所述疫苗抗原是从由SEQIDNo.1表示的密码子优化的基因序列获得的。


3.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中具有蛋白SEQID4的所述疫苗抗原是从由SEQIDNo.3表示的密码子优化的基因序列获得的。


4.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自以下的组：alum(磷酸铝、氢氧化铝)，基于角鲨烯的佐剂诸如MF59、montanide，RIBI佐剂，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂，MPL，胞壁酰二肽，水包油乳剂，基于TLR配体的佐剂，CpG寡核苷酸，非CpG寡核苷酸，皂苷诸如QS-1、ISCOM、ISCOMATRIX，维生素，以及免疫调节剂诸如细胞因子。


5.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述稳定剂选自糖5％-60％蔗糖或5％-40％海藻糖或者糖醇如5％-40％甘油或5％-40％山梨糖醇。


6.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗抗原SEQIDNo.2和SEQIDNo.4通过包括以下的方法制备：
a.在15℃-37℃之间用0.2mM-0.75mMIPTG，在合适的宿主中以包涵体的形式分别由密码子优化的基因序列，即SEQIDNo.1和SEQIDNo.3表达蛋白序列SEQIDNo.2和SEQIDNo.4，所述宿主选自大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞或Rosetta细胞；
b.以10,000rpm离心5分钟，以获得在细胞沉淀物中的感兴趣的蛋白；
c.用裂解缓冲液-I悬浮步骤(b)的沉淀物，同时进行至少3次冻融循环，随后进行20秒的超声处理，其间间隔至少30秒，用于MEV1的所述裂解缓冲液-I包含50mMNa2HPO4、0.3MNaCl、1％TritonX-114、0.5mg/ml溶菌酶、1mMAEBSF；
d.可选地，用用于MEV2的裂解缓冲液-I进行裂解，用于MEV1的所述裂解缓冲液-I包含用于MEV2的裂解缓冲液-I，所述用于MEV2的裂解缓冲液-I包含50mMTris、0.3MNaCl、1％TritonX114、0.5mg/ml溶菌酶、1mMAEBSF，pH8-8.5；
e.在4℃用用于MEV1的裂解缓冲液-II进行细胞裂解持续3-16小时，以回收在pH7.4的MEV1的不溶性蛋白，以获得MEV1的变性蛋白溶液，用于MEV1的所述裂解缓冲液-II包含3M-6M尿素、5mM-10mM咪唑、50mMNa2HPO4、0.3MNaCl和1mMAEBSF；
f.可选地，在6M尿素和10mM-20mMDTT的存在下，用用于MEV2的裂解缓冲液-II进行细胞裂解，用于MEV2的所述裂解缓冲液-II包含50mMTris、0.3MNaCl、1mMAEBSF；
g.将以上步骤(e)的所述变性蛋白溶液添加至Ni-NTA固定化金属亲和色谱柱，随后用洗涤缓冲液-I洗涤，所述洗涤缓冲液-I包含50mMNa2HPO4、0.3MNaCl、1mMAEBSF、3M尿素，pH7.4，以及0.1％TritonX-114和5mM-10mM咪唑；
h.对于MEV1，在以上步骤(g)之后，用洗涤缓冲液-II再次进行洗涤，所述洗涤缓冲液-II包含50mMNa2HPO4、0.3MNaCl、1mMAEBSF、3M-6M尿素，pH7.4，以及0.1％TritonX-114和20mM咪唑；随后通过洗涤缓冲液-III洗涤，所述洗涤缓冲液-III包含50mMNa2HPO4、0.3MNaCl、1mMAEBSF，另外具有20mM咪唑以及浓度递减的尿素；
i.在任选具有3M-6M尿素的情况下，通过使咪唑浓度递增(250mM-500mM)，用洗脱缓冲液洗脱靶蛋白MEV1，所述洗脱缓冲液包含50mMNa2HPO4、0.3MNaCl、1mMAEBSF；
j.在以上步骤(i)之后，使用10kDa截止的膜对MEV-1进行针对磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿米特·拉伊乔度里，
申请(专利权)人：巴拉特生物技术国际有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN