具有内置六螺旋束蛋白的自组装蛋白纳米粒子制造技术

本发明专利技术涉及具有内置六螺旋束蛋白的自组装蛋白纳米粒子。包含环区的蛋白质或肽，通过将它们附连到六螺旋束(SHB)蛋白并整合到自组装蛋白纳米粒子(SAPN)中而被稳定化。

Self-assembled protein nanoparticles with six helix bundles

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有内置六螺旋束蛋白的自组装蛋白纳米粒子
本专利技术涉及具有内置六螺旋束蛋白的自组装蛋白纳米粒子。包含环区的蛋白质或肽，通过将它们附连到六螺旋束(SHB)蛋白并整合到自组装蛋白纳米粒子(SAPN)中而被稳定化。
技术介绍
包膜病毒的表面蛋白在病毒感染的早期阶段是极为重要的。例如，在免疫缺陷病毒(人中的HIV，猿猴中的SIV)中，它们在病毒对接到细胞表面后介导病毒包膜与细胞膜的直接融合。在流感病毒血细胞凝集素(HA)蛋白中发生类似的结构变化，并且据推测，流感病毒中的HA或HIV中的糖蛋白160(gp160)的大规模结构重排，对于许多包膜病毒蛋白来说是从亚稳定的本源(促融合前)状态向稳定的融合活性(促融合)状态转变的原因。这些蛋白的细胞外结构域表现出具有几个特点的结构域组织，所述特点是特征性的并且可能在反转录病毒膜融合的活化期间决定它们的功能。这些蛋白通常由N-端区段和后面跟随的被含有二硫键的环结构隔开的两个七肽重复序列构成。这些环结构可能非常大，并含有完全折叠的结构域例如HA的头部结构域。靠近所述N-端末端存在疏水区段(融合肽)，其据认为在融合过程中的早期阶段被插入到细胞膜中。这些蛋白含有两个具有7个氨基酸的疏水重复序列(七肽重复序列)的区域，这是卷曲螺旋结构的关键特征。在HIV的情况下，在膜融合过程的早期阶段中，三聚包膜糖蛋白含有处于其促融合前构象下的gp41(作为gp160的一部分)。在结合到受体CD4并随后结合到辅助受体CXCR5/CCR4后，形成一种瞬时的gp41物质即所谓的发夹前中间体以暴露出所述融合肽区，并在同时形成N-端卷曲螺旋三聚体。然后通过所述C-端七肽重复序列区与所述三聚N-端卷曲螺旋的结合形成融合活性发夹结构，并导致病毒和细胞的膜的并置(Pancera,M.等，Nature2014,514(7523):455-461)。已知B-细胞表位的构象特异性展示对于诱导保护性免疫应答来说是关键的。这种免疫应答以产生以高特异性容易地识别感兴趣的抗原的构象特异性抗体为特征。B-细胞表位的正确构象依赖于所述蛋白的正确折叠或重折叠。各种不同的方法已被用于展示采取本源构象的表面糖蛋白。通常，尝试通过将三聚蛋白结构域例如卷曲螺旋或fibritin的折叠子(foldon)结构域(Guthe,S.等，JMolBiol2004,337(4):905-915)附连到感兴趣的分子，以使所述糖蛋白三聚体稳定。已显示了将这种方法用于流感病毒的HA分子，其中通过将HA附连到所述折叠子(foldon)结构域，实现了HA茎结构域的正确折叠以及因此的构象特异性展示(Lu,Y.等，ProcNatlAcadSciUSA2014,111(1):125-130)。使用铁蛋白纳米粒子固有的三聚对称性，Kanekiyo等人已经证实，HA当被工程化到这种纳米颗粒系统上时被正确折叠(Kanekiyo,M.等，Nature2013,499(7456):102-106)。在精心设计的实验方法中，将HIV的SHB用于设计HA中间体，以找出HA的最佳茎设计。在这种方法中，HA中间体的体系结构可以被描述为B1–L1–SHB1–L2–SHB2–L3–B2，即B-细胞表位不形成环结构，而是将SHB内置到所述B细胞表位中，因此将它分成两个分开的片段B1和B2。此外，所述SHB不是用于疫苗接种的HA免疫原的最终茎设计的一部分(Yassine,H.M.等，NatMed2015,21(9):1065-1070)。此外，已证实了通过SHB将RSVF蛋白稳定化(WO2014/079842A1)。在这种方法中，两个SHB的螺旋位于分开的多肽链上。病毒三聚体糖蛋白的正确重折叠通常只能在真核蛋白表达系统中实现。重折叠期间的环形成对于包膜病毒的亚稳定糖蛋白的正确构象来说是关键的，这一点已用HA证实(Daniels,R.等，MolCell2003,11(1):79-90)。在真核蛋白表达期间，环形成在ER膜上自然实现，其中HA在蛋白质合成和蛋白质折叠期间保持在环构象下(Daniels,R.等，MolCell2003,11(1):79-90)。现在已令人吃惊地发现，如果寡聚体蛋白例如三聚体蛋白形成环结构，即所述蛋白的N-端和C-端极为靠近，则代替使用简单的寡聚体结构域，可以使用SHB来改善所述形成环的蛋白质的稳定化。因此，代替仅在一端上使用简单的三聚卷曲螺旋结构域或fibritin的折叠子(foldon)结构域，所述形成环的蛋白可以通过将其两个末端(即N-端和C-端)附连到两个SHB的螺旋的末端而被稳定化。作为实例，流感病毒HA可以将其N-端和C-端附连到HIVgp41的SHB，由此将它锁定在亚稳定的融合前构象下。然后可以将这种具有内置三聚体B-细胞表位的SHB工程化到SAPN的结构体系中，由此产生新的SAPN骨架。这种新的纳米粒子骨架理想地适合作为支架，以在所述纳米粒子的表面上呈递以环结构折叠的蛋白质(即所述蛋白质的N-端和C-端彼此极为靠近)。这种纳米粒子支架允许使环结构蛋白稳定在其本源构象下。特别感兴趣的是形成三聚体的环结构蛋白。非常有趣的是，许多包膜病毒的表面蛋白正好具有这种三聚体环结构。实例是流感病毒HA、CMV的gB蛋白、RSV的F蛋白、HIV的gp160和许多其他蛋白。这些包膜病毒的三聚体表面蛋白处于亚稳定的促融合前状态下，所述状态可以通过将它工程化在本专利技术的纳米粒子内SHB的螺旋-环-螺旋基序上而被稳定化。或者，可以使用SHB-SAPN作为支架，将三聚体蛋白的亚结构一起保持在三聚体构象下。此外，也可以将简单的环结构作为环展示在SHB-SAPN上，不需要并且不强调形成特定三聚体构象，而是简单地约束在环结构中。本专利技术的SHB-SAPN提供了一种非常优美的方式将形成环的肽和蛋白质以它们的本源构象展示。作为形成环的肽和蛋白质的B-细胞表位可以非常简单例如β-转角肽，但是它们也可以是非常复杂的结构如包膜病毒的三聚体表面糖蛋白。
技术实现思路
本专利技术涉及一种自组装蛋白纳米粒子(SAPN)，其由多个式(Ia)或式(Ib)的构件构成：X1–ND1–L1–SHB1–L2–B–L3–SHB2–Y1(Ia)或Y1–SHB2–L3–B–L2–SHB1–L1–ND1–X1(Ib)，所述构件由包含寡聚化结构域ND1、连接物L1、结构域SHB1、连接物L2、包含环区的结构域B、连接物L3、结构域SHB2和其他取代基X1和Y1的连续链构成，其中，ND1是包含m个亚基ND1的寡聚物(ND1)m的肽或蛋白质，SHB1和SHB2彼此独立地是六螺旋束肽或蛋白质的螺旋，m是2至10之间的数字，前提是m不等于3并且不是3的倍数，L1、L2和L3是连接物，它们彼此独立地是肽键或肽链，B是包含环区的肽或蛋白质，X1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，Y1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，其中所述多个式(Ia本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.自组装蛋白纳米粒子(SAPN)，其由多个式(Ia)或式(Ib)的构件构成：/nX1–ND1–L1–SHB1–L2–B–L3–SHB2–Y1 (Ia)或/nY1–SHB2–L3–B–L2–SHB1–L1–ND1–X1 (Ib)，/n所述构件由包含寡聚化结构域ND1、连接物L1、结构域SHB1、连接物L2、包含环区的结构域B、连接物L3、结构域SHB2和其他取代基X1和Y1的连续链构成，其中，/nND1是包含m个亚基ND1的寡聚物(ND1)

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170323 EP 17162540.31.自组装蛋白纳米粒子(SAPN)，其由多个式(Ia)或式(Ib)的构件构成：
X1–ND1–L1–SHB1–L2–B–L3–SHB2–Y1(Ia)或
Y1–SHB2–L3–B–L2–SHB1–L1–ND1–X1(Ib)，
所述构件由包含寡聚化结构域ND1、连接物L1、结构域SHB1、连接物L2、包含环区的结构域B、连接物L3、结构域SHB2和其他取代基X1和Y1的连续链构成，其中，
ND1是包含m个亚基ND1的寡聚物(ND1)m的肽或蛋白质，
SHB1和SHB2彼此独立地是六螺旋束肽或蛋白质的螺旋，
m是2至10之间的数字，前提是m不等于3并且不是3的倍数，
L1、L2和L3是连接物，它们彼此独立地是肽键或肽链，
B是包含环区的肽或蛋白质，
X1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，
Y1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，
其中所述多个式(Ia)或式(Ib)的构件任选地与多个式(IIa)或式(IIb)的构件共同组装：
X2–ND2–L1–SHB1–L2–B–L3–SHB2–Y2(IIa)或
Y2–SHB2–L3–B1–L2–SHB1–L1–ND2–X2(IIb)，
所述构件由包含寡聚化结构域ND2、连接物L1、结构域SHB1、连接物L2、包含环区的结构域B、连接物L3、结构域SHB2和其他取代基X2和Y2的连续链构成，其中，
ND2是包含m个亚基ND2的寡聚物(ND2)m的肽或蛋白质，
SHB1和SHB2彼此独立地是六螺旋束肽或蛋白质的螺旋，
m是2至10之间的数字，前提是m不等于3并且不是3的倍数，
L1、L2和L3是连接物，它们彼此独立地是肽键或肽链，
B是包含环区的肽或蛋白质，
X2不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，
Y2不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，
并且其中式(IIa)和/或式(IIb)的X2和Y2中的至少一者不同于式(Ia)和/或式(Ib)的X1和Y1。


2.根据权利要求1所述的蛋白纳米粒子，其中所述式(Ia)或式(Ib)的寡聚化结构域ND1、连接物L1、结构域SHB1、连接物L2、包含环区的结构域B、连接物L3和结构域SHB2，与所述式(IIa)或式(IIb)的寡聚化结构域ND2、连接物L1、结构域SHB1、连接物L2、包含环区的结构域B、连接物L3和结构域SHB2一致。


3.根据权利要求1所述的蛋白纳米粒子，其中ND1和/或ND2是卷曲螺旋。


4.根据权利要求3所述的蛋白纳米粒子，其中ND1和/或ND2是五聚卷曲螺旋。


5.根据权利要求4所述的蛋白纳米粒子，其中ND1和/或ND2是选自4PN8、4PND、4WBA、3V2N、3V2P、3V2Q、3V2R、4EEB、4EED、3MIW、1MZ9、1FBM、1VDF、2GUV、2HYN、1ZLL和1T8Z的五聚卷曲螺旋，或者其中ND1和/或ND2是选自4PN8、4PND、4WBA、3V2N、3V2P、3V2Q、3V2R、4EEB、4EED、3MIW、1MZ9、1FBM、1VDF、2GUV、2HYN、1ZLL和1T8Z的五聚卷曲螺旋，其含有氨基酸修饰和/或在任一末端或两个末端处缩短，其中每个卷曲螺旋按照RCSB蛋白质数据库(RCSBPDB)的pdb编目号指示。


6.根据权利要求3所述的蛋白纳米粒子，其中ND1和/或ND2是四聚卷曲螺旋。


7.根据权利要求6所述的蛋白纳米粒子，其中ND1和/或ND2是来自于tetrabrachion的四聚卷曲螺旋(1FE6)或含有氨基酸修饰和/或在任一末端或两个末端处缩短的来自于tetrabrachion的四聚卷曲螺旋(1FE6)，其中所述来自于tetrabrachion的四聚卷曲螺旋按照RCSB蛋白质数据库(RCSBPDB)的pdb编目号指示。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白纳米粒子，其中所述结构域SHB1和/或SHB2各自独立地选自4I2L、3W19、3VTQ、3VU5、3VU6、3VTP、3...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡罗琳·库兰加拉，萨拉·玛丽亚·保罗，马特奥·普拉扎，森蒂尔·库马尔·拉曼，彼得·布克哈德，
申请(专利权)人：阿尔法O肽股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH