一种沙门菌菌蜕疫苗的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种沙门菌菌蜕疫苗的制备方法及应用，利用λ‑Red系统制备获得鸡白痢沙门菌pagC基因缺失突变株ΔPagC；取过夜培养的ΔPagC菌液，1:100接种到50ml液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD值约0.8；4℃，5000rpm离心10min后用无菌的PBS缓冲液洗涤3次，然后用终浓度为50μM的MAP溶液重悬菌体至OD值为0.3，21℃恒温静置16h，4℃、5000rpm离心10min收集菌体，进行灭菌效果检测和核酸残留检测；检测合格后调整剂；与佐剂1:1混合，充分乳化后接种动物。本发明专利技术疫苗株接种小鼠后无不良反应，可保护小鼠应对鸡白痢沙门菌CVCC1800、肠炎沙门菌ATCC19585和鼠伤寒沙门菌CVCC542的感染；该疫苗能够能与基于PagC蛋白的沙门菌抗体间接ELISA检测试剂盒联用，实现沙门菌人工免疫和自然感染的鉴别诊断，表现出良好的DIVA特性。

【技术实现步骤摘要】
一种沙门菌菌蜕疫苗的制备方法及应用
本专利技术涉及兽医学生物制品
，具体为一种沙门菌菌蜕疫苗的制备方法及应用。
技术介绍
沙门菌病长期困扰着各国养殖业，是沙门菌属的不同血清型感染动物后引起的多种疾病的总称。该病对幼畜和幼禽的危害最为严重，表现为肠热、急性败血症等致死性病症，成年畜禽多呈慢性或隐性感染。患病和带菌动物是本病的主要传染源，不仅在种群中持续排毒，也可以垂直传播给下一代。疫苗是控制该病的有效手段，但是传统灭活疫苗由于不良反应明显，引起细胞介导的免疫应答的能力较弱等问题无法满足市场的需求。而且根据临床病症对群体进行阳性净化的方法无法及时淘汰隐性感染的群体，因此亟需开发一种免疫效果良好且具有DIVA(DifferentiationofInfectedandVaccinatedAnimals)特性的新型疫苗，通过与血清学检测相配合来实现沙门菌的有效净化。细胞穿透肽(cellpenetratingpeptides，CPPs)是一些能够穿透细胞膜的小分子多肽，具有与抗微生物肽类似的功能。它们一般长度不超过30个氨基酸。MAP就是其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种沙门菌菌蜕疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤S1，利用λ-Red系统制备获得鸡白痢沙门菌基因缺失突变株ΔPagC；/n步骤S2，缺失株LB平板划线，挑取单菌落转接到新鲜的LB培养基中过夜培养；/n步骤S3，取过夜培养的鸡白痢沙门菌ΔPagC菌液，1:100接种到50ml液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD值约0.8；/n步骤S4，4℃，5000rpm离心10min后用无菌的PBS缓冲液洗涤3次，然后用终浓度为50μM的MAP溶液重悬菌体至OD值为0.3，21℃恒温静置16h，4℃、5000rpm离心10min收集菌体；/n步骤S5，再次洗涤重悬后获得菌蜕...

【技术特征摘要】
1.一种沙门菌菌蜕疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，利用λ-Red系统制备获得鸡白痢沙门菌基因缺失突变株ΔPagC；
步骤S2，缺失株LB平板划线，挑取单菌落转接到新鲜的LB培养基中过夜培养；
步骤S3，取过夜培养的鸡白痢沙门菌ΔPagC菌液，1:100接种到50ml液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD值约0.8；
步骤S4，4℃，5000rpm离心10min后用无菌的PBS缓冲液洗涤3次，然后用终浓度为50μM的MAP溶液重悬菌体至OD值为0.3，21℃恒温静置16h，4℃、5000rpm离心10min收集菌体；
步骤S5，再次洗涤重悬后获得菌蜕原液，多次调整原液使其稀释10倍后测得的OD值为1(此时原液的浓度大约在109CFU/ml)；
步骤S6，将原液浓缩一倍后与佐剂进行1:1混合，然后加到2ml的灭菌匀浆管(含钢珠)中，使用组织匀浆仪中进行乳化，待乳化完全后，取100μl均匀涂布于LB固体培养基上，37℃培养16h后观察无菌落长出，此时成功制备鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC菌蜕疫苗。


2.根据权利要求1所述的一种沙门菌菌蜕疫苗的制备方法，其特征在于：
MAP作用条件的确定及细菌灭活效率的计算；
MAP是细胞穿孔肽的一种，分子式为C90H170N24O18，分子量大小1876.51，由18个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为H-KLALKLALKALKAALKLA-NH2，该细胞穿孔肽交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本试验通过使用细胞穿透肽MAP来制备鸡白痢沙门菌ΔPagC菌蜕，根据其溶菌效果来确定MAP的最佳使用条件；
鸡白痢沙门菌ΔpagC缺失株LB平板划线，挑取单菌落转接到新鲜的LB培养基中过夜培养；次日将其按照1:100接种到50ml液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD值约0.8；4℃、5000rpm离心10min收集菌体沉淀，洗涤重悬3次后，用无菌的PBS缓冲液将菌体分别稀释到OD值为0.1，0.2，0.3，0.4和0.5，每个OD值的菌液倍比稀释至合适的稀释度，每个稀释度设3个重复；从稀释液中取出100μl均匀涂布在LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后进行菌落计数，统计CFU；
同时，用含10μM、30μM、50μMMAP的Na2HPO4溶液分别将菌体稀释到OD值为0.1，0.2，0.3，0.4和0.5，每种处理设3个重复；将其转接到96孔板，每孔200μl，21℃恒温培养作用1h；培养结束后，每孔取100μl均匀涂在LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后进行菌落计数；根据CFU统计结果，计算MAP的细菌灭活效率；大量制备疫苗时，在上述试验确定的条件基础上，采用100ml菌液进行制备，并计算灭活效率；
其计算公式为：灭活率＝(1－MAP作用后CFU/PBS重悬CFU)×100％；
用终浓度为50μM的MAP溶液处理OD值为0.3的沙门菌ΔPagC菌液，对制备的菌蜕疫苗进行灭活效果检测；当处理体积为200μl时，细菌的裂解效率为100％；当处理体积为100ml时，发现有少量的细菌生长，经计算得知细菌的实际灭活效率可达99％；说明随着待处理菌液体积的增加，MAP溶液的灭活效...

【专利技术属性】
技术研发人员：马喆，左庚亮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32