一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法技术

一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下工艺步骤：1）病毒增殖；2）鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗制备，在每1000ml灭活检验合格的鸡传染性法氏囊病病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗。本发明专利技术采用了新的疫苗佐剂，所制备的疫苗具有油包水、水包油双重特性，兼具了疫苗的缓释作用以及水溶性免疫增强剂、中药黄酮、镇痛剂等共同作用的优点。本发明专利技术采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高灭活疫苗细胞免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
鸡传染性法氏囊病(Infectionbursaldisease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectionbursaldiseasevirus，IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病，主要感染3～12周龄的青年鸡，该病毒主要在法氏囊的淋巴细胞内增殖，并且对其它免疫器官造成不同程度的损伤，最终导致鸡的法氏囊萎缩而引起鸡的免疫抑制。本病在临床上可以导致体重减轻、生长缓慢和骨骼肌出血等症状，小于3周龄的鸡则不会表现出明显的临床特征。但是，在亚临床感染的鸡法氏囊上也会有一些镜检病理变化和免疫抑制现象，给养鸡业带来了巨大的经济损失。本病可以导致鸡本身对其他疾病的抵抗力减弱，并且干扰如新城疫、马立克氏病和传染性支气管炎等病的疫苗的免疫效果。目前，IBDV疫苗的种类主要包括活疫苗、灭活疫苗、抗原抗体复合物疫苗、基因工程疫苗等。根据国内外活疫苗的临床使用情况来看，活疫苗虽然可以起到一部分保护作用，但是存在自身法氏囊萎缩的情况，从而导致自身免疫系统的紊乱，另外基因工程疫苗、抗原抗体复合物疫苗同样存在保护率偏低的情况。灭活疫苗免疫鸡只后可以产生较高的抗体，能够有效的保护机体，但是目前国内的法氏囊灭活疫因其免疫效果差或生产成本高，没有得到广泛推广，各大种鸡场使用的大多还是价格昂贵的进口疫苗。新城疫、鸡传染性法氏囊病是造成雏鸡高死亡率的两种重大传染病，严重制约着养鸡业的健康成长。做好这两种疾病的防疫工作，特别是1日龄雏鸡的防疫工作，是保证养鸡业健康发展的前提。因此，开发一种即能用于成鸡又能用于雏鸡免疫预防这两种疾病的安全、有效的疫苗已刻不容缓。针对养鸡业上述问题，本项目的提出可以解决养鸡业中成鸡与雏鸡新城疫、传染性法氏囊病的免疫预防难题，降低行业内疾病的流行，增加出栏率，为我国的养鸡业保驾护航。水包油包水乳化佐剂具有铝胶佐剂、水包油佐剂和油包水佐剂的特点，与油包水乳化佐剂相比，其制备疫苗所需要的抗原浓度大大降低，另外因其具有水包油佐剂的特性，使得其可以添加水溶性的免疫增强剂、中药多糖和镇痛剂（维生素），在疫苗免疫机体时可以缓解疼痛，减少动物应激，同时免疫增强剂、中药多糖还具有提高免疫效果，预防疾病等功能。维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。法氏囊素(bursin，BS)是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursaoffabricius)中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。本专利技术基于上述技术背景，提出一种鸡传染性法氏囊复合灭活疫苗的制备方法，该疫苗由鸡传染性法氏囊抗原加适量含免疫增强剂制成，剂型为水包油包水型。通过该方法制备的复合灭活疫苗，因其拥有水包油，油包水两种特性，使得水溶性的维生素、法氏囊素、中药黄酮等免疫增强剂与镇痛剂易于溶解，利于动物机体吸收，免疫时可降低动物应激，减少动物痛苦，可提高动物福利；同时免疫增强剂可大大提高活疫苗的细胞，产生较高的中和抗体，大幅提高保护率。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法的技术方案。所述的一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）病毒增殖（1）DF-1细胞的传代取培养24-48小时以内，细胞形态良好，分布均匀且长满单层的细胞瓶，弃去细胞培养液，向细胞培养瓶中加入胰蛋白酶溶液消化；倒掉细胞消化液，然后向细胞瓶内加入含10%胎牛血清的DMEM/F12细胞生长液，用吸管轻吹细胞表面，使细胞脱落并分散均匀，然后加入细胞生长液按1:3-4传代；（2）接种待24-48小时细胞长成单层后进行换液和接毒，取生产用毒种，按细胞维持液量的1%接种已长成良好单层的DF-1细胞，置37℃继续培养，细胞维持液为含2%胎牛血清的DMEM/F12溶液；（3）收获接毒后24-48小时，待细胞病变达到75%以上时收获细胞液；2）鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗制备将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的鸡传染性法氏囊病病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，每份免疫增强剂含有中药黄酮10～20g、维生素组合3～6g和法氏囊素10～20mg，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗，上述的中药黄酮由菊花10～30份、生地10～30份、蔓荆子20～40份、龙胆草10～20份、黄芩10～30份、土茯苓20～30份和玄参10～30份构成的中药组合物中提取得到。所述的一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药黄酮通过以下步骤制得：a、按菊花10～30份，生地10～30份，蔓荆子20～40份，龙胆草10～20份，黄芩10～30份，土茯苓20～30份，玄参10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。所述的一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）病毒增殖（1）DF‑1细胞的传代取培养24‑48小时以内，细胞形态良好，分布均匀且长满单层的细胞瓶，弃去细胞培养液，向细胞培养瓶中加入胰蛋白酶溶液消化；倒掉细胞消化液，然后向细胞瓶内加入含10%胎牛血清的DMEM/F12细胞生长液，用吸管轻吹细胞表面，使细胞脱落并分散均匀，然后加入细胞生长液按1:3‑4传代；（2）接种待24‑48小时细胞长成单层后进行换液和接毒，取生产用毒种，按细胞维持液量的1%接种已长成良好单层的DF‑1细胞，置37℃继续培养，细胞维持液为含2%胎牛血清的DMEM/F12溶液；（3）收获接毒后24‑48小时，待细胞病变达到75%以上时收获细胞液；2）鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗制备将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的鸡传染性法氏囊病病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，每份免疫增强剂含有中药黄酮10～20g、维生素组合3～6g和法氏囊素10～20mg，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗，上述的中药黄酮由菊花10～30份、生地10～30份、蔓荆子20～40份、龙胆草10～20份、黄芩10～30份、土茯苓20～30份和玄参10～30份构成的中药组合物中提取得到。...

【技术特征摘要】
1.一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）病毒增殖
（1）DF-1细胞的传代
取培养24-48小时以内，细胞形态良好，分布均匀且长满单层的细胞瓶，弃去细胞培养液，向细胞培养瓶中加入胰蛋白酶溶液消化；倒掉细胞消化液，然后向细胞瓶内加入含10%胎牛血清的DMEM/F12细胞生长液，用吸管轻吹细胞表面，使细胞脱落并分散均匀，然后加入细胞生长液按1:3-4传代；
（2）接种
待24-48小时细胞长成单层后进行换液和接毒，取生产用毒种，按细胞维持液量的1%接种已长成良好单层的DF-1细胞，置37℃继续培养，细胞维持液为含2%胎牛血清的DMEM/F12溶液；
（3）收获
接毒后24-48小时，待细胞病变达到75%以上时收获细胞液；
2）鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗制备
将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的鸡传染性法氏囊病病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，每份免疫增强剂含有中药黄酮10～20g、维生素组合3～6g和法氏囊素10～20mg，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗，上述的中药黄酮由菊花10～30份、生地10～30份、蔓荆子20～40份、龙胆草10～20份、黄芩10～30份、土茯苓20～30份和玄参10～30份构成的中药组合物中提取得到。
2.如权利要求1所述的一种鸡传染性法氏囊病复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药黄酮通过以下步骤制得：
a、按菊花10～30份，生地10～30份，蔓荆子20～40份，龙胆草10～20份，黄芩10～30份，土茯苓20～30份，玄参10～30份称取各中药...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建军，张秀文，李阳，
申请(专利权)人：浙江美保龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33