通过表面活性剂介导的制备型HPLC纯化有机化合物制造技术

尽管在产生反相衍生化二氧化硅固定载体方面有新进展，然而仅有两种方式增大可以通过制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)在单次运行中纯化的样品的量：(1)传统方法是使用较大的柱(较大量的固定相)；以及(2)使用置换色谱法，其(同时劳动密集型开发的)更有效地使用固定相。本发明专利技术描述独特的Prep-RP-HPLC技术，其使用涂覆有表面活性剂例如曲通X-100的C-18/C-8衍生化的二氧化硅导致与常规Prep-RP-HPLC技术相比在(包含合成的粗制肽的有机化合物的粗制混合物的)样品负载方面7至10倍的增大。样品负载容量和输出的这种增大是由于C-18/C-8吸附的(结合的)表面活性剂的附加的替代固定相特性。表面活性剂通过与固定相的残余硅醇的范德华力(疏水性相互作用)和离子相互作用被结合至固定相的C-18/C-8链。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过表面活性剂介导的制备型HPLC纯化有机化合物
本专利技术涉及有机化合物的纯化。更具体地，本专利技术涉及一种使用制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)纯化包含肽的有机化合物的新颖的方法，所述方法与用于使用表面活性剂作为替代固定相(surrogatestationaryphase)(SSP)/附加固定相(APS)纯化包含肽的有机化合物的传统的Prep-RP-HPLC相比具有其样品负载容量(loadingcapacity)和输出的7倍至10倍。增大的样品负载容量是由于在C-18/C8链上的用作添加的固定相(ASP)的吸附的表面活性剂。专利技术背景反相高效液相色谱法(RP-HPLC)在学术机构、法医实验室、精细化学、和制药工业等等中被广泛地用于小的有机分子、天然产物和生物活性分子(例如多肽、蛋白质和核苷酸)的分析、表征、分离、纯化和/或离析(isolation)。在制药工业中，分析型RP-HPLC被用于释放和表征原材料、中间体、和活性药物成分(API)。相比之下，制备型色谱法被用于纯化用于另外用途的充分量的物质。同时分析型RP-HPLC的主要目标是分析物的鉴定和定量，而在制药工业和精细化学工业中，Prep-RP-HPLC的主要目的是包含肽API、和没有义务结晶的大部分其他复合API的API、以及精细化学品的商业生产。在洗脱模式中的Prep-RP-HPLC最广泛地被实践并且是用于纯化粗制肽混合物以及其他小的复合有机分子的优选模式。在洗脱制备型色谱法中，将待纯化的化合物的粗制混合物溶解在合适的溶剂{例如，在水中的0.1％三氟乙酸(TFA)，缓冲液A}中并且结合至C-18/C-8衍生化的二氧化硅固定相载体(support)。当运行流动相(在50％至100％乙腈中的0.1％TFA，缓冲液B)梯度(通常A至B的线性梯度)时，在流动相和固定相之间建立平衡。取决于它们对于固定相的亲合力，各种样品物质以反映它们对于固定相的相对亲合力的速度沿着柱穿过。弱结合物质首先洗脱，随后是较强的粘合剂。总之，有机缓冲液组分的浓度的逐渐增大导致混合物的组分的解吸(desorption)和拆分(resolution)。洗脱Prep-RP-HPLC模式在可以在单次运行中被纯化的样品的量方面被若干因素限制，包括期望产物及其最近的洗脱相关的物质之间的拆分、容量因子、以及制备型柱的理论塔板数(numberoftheoreticalplate)等等。DonaldA.Wellings在他的书“APracticalHandbookofPreparativeHPLC,Elsevier(2006)”中已经完美地描述许多这些方面。合成的肽的典型的负载容量在1mg每ml填充柱体积至2mg每ml填充柱体积的范围内(即，关于总的柱体积的0.1％至0.2％)。较早的Prep-RP-HPLC固定载体是用C-18或C-8链衍生化的不规则的二氧化硅颗粒，并且它们经受高背压。高背压限制它们关于可以在单次运行中被纯化的量以及关于相对较小的直径的柱的用途。Prep-RP-HPLC的最近的进步已经集中于生产球形的二氧化硅以及开发新的键合化学以提供具有改进的稳定性和选择性的固定载体。已经被C-18、C-8和其他的配体衍生化的球形的二氧化硅的商业制造已经克服这些挑战并且已经极大地扩展制备型HPLC的实用性。在工艺HPLC仪器和键合二氧化硅载体中的技术进步已经使得以数百千克的量的复合肽例如(36种氨基酸的肽)的商业生产成为可能。遗憾地，这些大规模HPLC仪器和相关的柱硬件是非常昂贵的并且限制方法的可承受性。另外，这些改进中没有一个既处理了给定的柱的负载容量，也没有使它们产生纯化的产物的量的明显提高(填充柱的输出/mL)。尽管这些上述提及的进步，但是当较早地被洗脱时，仅有两种方式增大可以在单次运行中被Prep-RP-HPLC纯化的样品的量：(1)传统的方法是使用较大的柱(较大量的固定相)；以及(2)使用置换色谱法，其(同时对于开发是费力的)更有效地使用固定相。置换色谱法利用具有比样品组分更高的对于固定相材料的亲合力的流动相置换剂溶液。区分置换色谱法与洗脱色谱法的关键操作特征是置换剂分子的使用。在洗脱色谱法中，洗脱剂通常具有比待分离的混合物中的组分的任何低的对于固定相的亲合力，而在置换色谱法中，作为置换剂的洗脱剂具有较高的亲合力。置换最好地适合于离子交换模式，并且已经发现大量近期的应用。专利US6239262公开了用于在疏水性相互作用和反相色谱模式中的蛋白质纯化的低分子量置换剂。专利技术人的PCT申请WO2014/118797A1描述了独特的Prep-RP-HPLC技术，其相比于常规的Prep-RP-HPLC技术实现(包含合成的粗制肽的化合物的粗制有机混合物的)样品负载的7倍至10倍的增大。相比于常规的Prep-RP-HPLC技术的输出的增大是由于C-18/C-8吸附的(结合的)季铵盐的附加的替代固定相特征。季铵盐通过与固定相的残余硅醇的范德华力(疏水性相互作用)和离子相互作用结合至固定相的C-18/C-8链。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供一种使用制备型反相高效液相色谱(Prep-RP-HPLC)技术纯化包含肽的有机化合物的新颖的方法。本专利技术的另一个目的是提供纯化包含肽的有机化合物的方法，所述方法与传统的Prep-RP-HPLC技术相比具有其样品负载容量和输出的7倍至10倍。本专利技术的另外的目的是提供使用表面活性剂作为替代固定相(SSP)/附加固定相(ASP)的这样的方法。专利技术概述本专利技术通过利用SSP实现较高的输出。SSP和置换色谱法协同地起作用以增大制备型色谱法的输出。本专利技术描述了用中性表面活性剂例如曲通X-100作为ASP涂覆的C-18/C-8衍生化的二氧化硅的用途(请参见图2)。本专利技术描述了使用Prep-RP-HPLC和中性表面活性剂作为SSP/ASP的用于肽的可扩展的(scalable)分离工艺。本专利技术是用于肽的简单的、成本效益好的且可扩展的分离工艺。因此，在一个实施方案中，本专利技术提供了一种包含肽的有机化合物的纯化的方法，所述方法使用替代固定相/附加固定相连同C-18/C-8衍生化的二氧化硅固定相在制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)中具有反相柱的增大的样品负载容量。C-18/C-8反相柱的制备负载容量通过用替代固定相/附加固定相涂覆/结合C-18/C-8反相柱来增大，其中替代固定相/附加固定相是中性表面活性剂或聚乙二醇化的表面活性剂。替代固定相/附加固定相表面活性剂可以选自烷基糖苷、胆汁酸、葡萄糖酰胺以及聚氧化乙烯，其中聚氧化乙烯选自曲通X-100(TritonX-100)、吐温-80(Tween-80)以及布里杰-35(Brij-35)，优选地曲通X-100。烷基糖苷选自具有下式的化合物R-O-(CH2)X-CH3，其中，当R＝葡萄糖时当R＝麦芽糖时X＝8，正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝11，十二烷基-β-D-麦芽糖苷X＝7，正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝9，十二烷基-β-D-麦芽糖苷X＝6，正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝9，癸基-β-D-麦芽糖苷X＝5，正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷。胆汁酸选自具有下式的化合物：胆汁酸其中，X＝H，R＝O本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含肽的有机化合物的纯化的方法，所述方法使用替代固定相/附加固定相连同C‑18/C‑8衍生化的二氧化硅固定相在制备型反相高效液相色谱法(Prep‑RP‑HPLC)中具有反相柱的增大的样品负载容量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.20 IN 4264/CHE/20131.一种包含肽的有机化合物的纯化的方法，所述方法使用替代固定相/附加固定相连同C-18/C-8衍生化的二氧化硅固定相在制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)中具有反相柱的增大的样品负载容量，其中所述替代固定相/附加固定相是中性表面活性剂或聚乙二醇化的表面活性剂。2.如权利要求1所述的方法，其中反相柱的制备负载容量通过用替代固定相/附加固定相涂覆/结合所述反相柱来增大。3.如权利要求1所述的方法，其中所述替代固定相/附加固定相的表面活性剂选自烷基糖苷、胆汁酸、葡萄糖酰胺以及聚氧化乙烯。4.如权利要求3所述的方法，其中所述聚氧化乙烯选自曲通X-100、吐温-80以及布里杰-35。5.如权利要求4所述的方法，其中所述表面活性剂是曲通X-100。6.如权利要求3所述的方法，其中烷基糖苷选自具有R-O-(CH2)X-CH3的式的化合物，其中，7.如权利要求3所述的方法，其中所述胆汁酸选自具有下式的化合物：胆汁酸其中，X＝H，R＝ONa，脱氧胆酸钠X＝H，R＝NHCH2CH2SO3Na，牛磺脱氧胆酸钠X＝H，R＝NHCH2CH2CO2Na，甘氨脱氧胆酸钠X＝OH，R＝ONa，胆酸钠X＝OH，R＝NHCH2CH2SO3Na，牛磺胆酸钠X＝OH，R＝NHCH2CH2CO2Na，甘氨胆酸钠。8.如权利要求3所述的方法，其中葡萄糖酰胺选自具有下式的化合物：葡萄糖酰胺其中，X＝8，MEGA-10X＝7，MEGA-9，X＝6，MEGA-8或，下式的化合物：其中，X＝H，脱氧BigCHAPX＝OH，BigCHAP。9.一种通过制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)纯化包含肽的有机化合物的多组分样品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)配置具有疏水性固定相的色谱系统；(b)用选自烷基糖苷、胆汁酸、葡萄糖酰胺以及聚氧化乙烯的替代固定相/附加固定相表面活性剂使色谱固定相饱和；(c)采用有机溶剂和水的混合物洗涤柱以除去过量的未结合的表面活性剂；(d)用起始流动相使所述柱平衡；(e)将多组分样品应用至包含涂覆有所述替代固定相/附加固定相表面活性剂的固定相的色谱床的一个端部；以及(f)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱所述多组分样品，其中所述缓冲液A是在水中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠，并且缓冲液B是在50％含水乙腈中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠；或(g)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱所述多组分样品，其中所述缓冲液A是0.1％的在水中的磷酸，并且缓冲液B是0.1％的在50％含水乙腈中的磷酸；或(h)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱所述多组分样品，其中所述缓冲液A是1％的在水中的磷酸，并且缓冲液B是1％的在50％含水乙腈中的磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆罕默德·哈利德·安瓦尔，
申请(专利权)人：拉马莫罕·拉奥·达瓦鲁利，
类型：发明
国别省市：印度;IN