本发明专利技术公开了采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法；该方法取干燥的金银花或其植物叶茎0.5～2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加乙醇，超声处理，得测试样溶液；取测试样溶液，上ODS色谱柱，梯度洗脱：洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液；流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化：检测波长在初始时刻t0至时刻t5期间采用320～340nm，然后转换波长为345～365nm进行检测；t5＝10～18min；依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。本发明专利技术提供一种灵敏度和精确度高，工作流程简便的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药、食品、保健品等行业领域，具体是一种同时测定具有生物活性的天然产物的HPLC方法，特别是涉及一种应用于HPLC中的波长转换技术，用于同时检测金银花中绿原酸，木犀草素，木犀草苷3种抗氧化活性成分。
技术介绍
金银花是我国传统中药，为忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾或待初开的花。其味甘，性寒，具有清热解毒、疏散风热，疏利咽喉、消暑除烦的作用，可治疗暑热症、泻痢、流感、疮疖肿毒、急慢性扁桃体炎、牙周炎等病。金银花主要含有挥发油、有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜苷类等生物活性成分。其中，以木犀草苷及其代谢前体木犀草素为代表的黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种药理作用。目前天然产物的检测方法有很多，主要有:紫外分光光度法、可见分光光度法、二阶导数光谱法、系数倍率法薄层色谱扫描法(TLC法)、高效液相色谱法(HPLC法)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)、导数极谱法和HPLC法与其它方法的联用。目前，随着分析检测技术的快速发展，传统的检测方法比如薄层色谱、分光光度法等逐渐地被精确的检测方法所取代。高效液相色谱法、气相色谱法等已经成为主流的检测方法。这些方法相对于传统方法，能够检测到天然产物单体化合物的含量，得到的试验数据更精确。绿原酸和木犀草苷是药材金银花中的代表性药效成分，中国药典2000年版公布了用高效液相法测定金银花中绿原酸含量的方法，2005年版新增并建立了用高效液相色谱法(HPLC法)来测定木犀草苷含量的标准方法，但由于绿原酸与木犀草苷分子结构差异较大，要采用不同的HPLC分析方法对两种物质含量进行分别测定，需要用到两种不同的色谱柱及检测条件，工作量大，测定时间长，不利于快速分析和大批量样品质量控制的需要。中国专利技术专利201110031466.4提出一种HPLC波长切换同时测定白芍及炮制品中9种成分含量方法，该方法利用同一种检测条件和波长切换的方法，既可以达到增加质量覆盖面的目的，又可以保证每种成分在最大吸收波长处被检测，提高检测灵敏度。中国专利技术专利201210079072.0提出一种HPLC波长切换技术同时测定牡丹皮、大黄牡丹皮药对及含大黄牡丹皮药对的制剂中多种成分含量的方法，该方法利用多不同时间段的不同梯度洗脱条件以及不同的检测波长，可依次测定样品中1-6种成分的含量。
技术实现思路
针对目前对于金银花中多种有效成分同时检测方法的存在空白缺失，以及HPLC检测方法在多种中药材成分检测中的应用现状，本专利技术提供一种灵敏度和精确度高，工作流程简便的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法。本专利技术建立一种基于HPLC的检测方法，首次提出基于HPLC转换波长技术及梯度洗脱技术应用于同时检测金银花中的3种标志性有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的方法。本专利技术方法根据金银花中3种有效成分分子性质的差异，运用HPLC梯度洗脱技术控制其洗脱时间，以及根据其分子结构及波谱性质差异，运用波长转换技术，达到同时检测的目的；采用梯度洗脱和检测器波长转换技术，通过调节色谱条件(流动相、柱温、流速、波长等)，实现金银花中绿原酸、木犀草素和木犀草苷3种抗氧化活性成分的同时定量检测。本专利技术目的通过如下技术方案实现:采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:1)测试样溶液的配制:取干燥的金银花或其植物叶茎0.5?2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加质量浓度为50?80%乙醇5?20ml，超声处理，过0.45μπι的滤膜，添加乙醇定容，得测试样溶液；2)测定金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量:取步骤1)的测试样溶液，上0DS色谱柱，梯度洗脱:洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的质量浓度为0.1?1.0% ;流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化情况如下: (1)第一梯度，从起始时刻Omin至时刻ti，质量百分比计，乙腈由初始的Caq上升到CAi;ti = 5?13min;CAo = 0.1 ?10% ;Cai=13?18% ；(2)第二梯度，从起始时刻乜至时刻t2，乙腈A由CA1上升到CA2 ； t2= 15?22min ； CA2 =20?26% ；(3)第三梯度，从时刻t2至时刻t3，乙腈A由Ca2上升到Ca3; t3 = 23?30min;CA3 = 28?35% ；(4)第四梯度，从t3至时刻t4，乙腈A由Ca3下降至Caq; t4=35?45min;控制洗脱液流速为0.5?1.0mL/min，柱温为20?40°C，检测波长在初始时刻to至时刻丨5期间采用320?340nm，然后转换波长为345?365nm进行检测；t5 = 10?18min;依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。优选地，所述超声处理的时间为10?50分钟。优选地，所述超声处理重复2次，合并2次超声处理的提取液。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点和有益效果:1)本专利技术首次提出基于HPLC转换波长技术及梯度洗脱技术，应用于同时检测金银花中的3种标志性有效成分绿原酸、木犀草素、木犀草苷的方法，该方法与传统检测手段相比具有简单、准确、快速、精密度高、重复性好的特点，对金银花药材及相关产品的质量控制具有较高的应用价值。2)减少工作流程。与中国药典(2010年版)中所录方法相比，本专利技术方法运用波长转换技术，能在同一色谱柱、同一色谱条件下上完成3种标志性有效成分的检测，缩短了一半以上的检测工作流程；3)提高检测的灵敏度和精确度。本专利技术方法采用梯度洗脱，洗脱过程中调整流动相乙腈与磷酸水的混合比例，使极性小的组分加快洗脱流出，使三个组分出峰时间分得较开，峰形好，大大提高了检测的灵敏度和精确度。4)增加金银花样品质量覆盖面。中国药典(2010年版)把绿原酸与木犀草苷的含量作为金银花的检测指标，而实际上木犀草素作为木犀草苷的代谢前体或代谢产物，同样存在在植物体内，并且木犀草苷进入人体后经代谢成木犀草素后发挥其生物活性。因此同时测定绿原酸、木犀草素、木犀草苷3种有效成分有利于增加金银花样品质量的检测指标，扩大其有效成分检测的覆盖面。【具体实施方式】为更好地理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术的实施方式不限如此。实施例1采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤:1.测试样溶液的配制:取干燥金银花0.5g，精密称定，切细并置具塞锥形瓶中，加入10m质量浓度为60 %乙醇，超声处理20min，倒出上清液，再加入10ml质量浓度为60 %乙醇，重复超声提取20min，合并提取液，过0.45μηι的滤膜，添加乙醇定容至50ml，得到金银花测试样溶液。2.对照样溶液的配制:分别精确称取一定量的绿原酸、木犀草素、木犀草苷对照品，于三个烧杯中充分溶解，用乙醇制成分别含绿原酸20yg/mL、木犀草素15yg/mL、木犀草苷15yg/mL的对照样溶液。3.测定金银花中3种有效成分绿原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色谱法，应用波长转换及梯度洗脱技术:取一份步骤1制备得到的测试样溶液，上0DS色谱柱(150X4.6πιπι，2μπι)，梯度洗脱，以质量本文档来自技高网...
【技术保护点】
采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤：1)测试样溶液的配制：取干燥的金银花或其植物叶茎0.5～2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加质量浓度为50～80％乙醇5～20ml，超声处理，过0.45μm的滤膜，添加乙醇定容，得测试样溶液；2)测定金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量：取步骤1)的测试样溶液，上ODS色谱柱，梯度洗脱：洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的质量浓度为0.1～1.0％；流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化情况如下：(1)第一梯度，从起始时刻0min至时刻t1，质量百分比计，乙腈由初始的CA0上升到CA1；t1＝5～13min；CA0＝0.1～10％；CA1＝13～18％；(2)第二梯度，从起始时刻t1至时刻t2，乙腈A由CA1上升到CA2；t2＝15～22min；CA2＝20～26％；(3)第三梯度，从时刻t2至时刻t3，乙腈A由CA2上升到CA3；t3＝23～30min；CA3＝28～35％；(4)第四梯度，从t3至时刻t4，乙腈A由CA3下降至CA0；t4＝35～45min；控制洗脱液流速为0.5～1.0mL/min，柱温为20～40℃，检测波长在初始时刻t0至时刻t5期间采用320～340nm，然后转换波长为345～365nm进行检测；t5＝10～18min；依次测定，计算出金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑必胜，陆建超，扶雄，刘瑞海，颜盛繁，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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