本发明专利技术提供一种B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，包括：核酸释放剂和PCR反应液，核酸释放剂包含莎梵婷0.05-0.5mM/L、氯化钾100-300mM/L、十二烷基磺酸钠0.05-3％和乙醇0.01-1％；PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针。本试剂盒采用核酸释放法，通过强烈蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，可以对围产期孕妇生殖道分泌物和直肠分泌物等未知样本中的B族链球菌-DNA进行快速检测，检测灵敏度可达500copies/ml，为诊断B族链球菌感染提供可靠的实验依据，可以解决现有技术检测特异性差以及灵敏度低的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种B族链球菌核酸检测试剂盒，具体设及一种B族链球菌PCR巧光 探针法核酸检测试剂盒。
技术介绍
B族链球菌（groupBstreptococcus,GB巧是一种寄生于人类泌尿生殖道及下消 化道的条件致病菌，健康人群带菌率可达35%。早在20世纪70年代B族链球菌就已经被 证实为围产期母婴感染的重要致病菌之一。定植于产妇生殖道的B族链球菌，可在分娩时 垂直传播给新生儿，而新生儿B族链球菌感染所引起的新生儿败血症、脑膜炎和肺炎等症 致死率极高，并可导致神经系统后遗症。2010年美国疾病预防中屯、制定了《围产期GBS预 防指南》，建议孕妇于妊娠35-37周进行GBS筛查。 目前，B族链球菌的诊断方法主要有培养法和免疫学方法，其中，培养法的特异性 和敏感性高，但临床检测时间过长（至少需要24h-4她，甚至更长时间），过程繁琐，需要 使用特殊的培养介质W及易受杂菌影响，不适用于大范围检测。免疫学方法，如：乳胶凝 集实验（latexagglutination,LA)，酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA)，协同凝集试验(^countercurrentimmunoelectrophotesis,CoA)及对流免疫 电泳kountercurrentimmunoelectrophotesis,CIE；)等，虽然特异性可W高达 95%，但是 敏感性不够，检出率较低。美国抑A已于1997年发出了运些方法假阴性和假阳性率均很高 的可行度警告，加之其试剂盒价格昂贵，所W运些方法的应用迅速减少。 近年来，聚核酶链式反应（PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，标准PCR过程分 为Ξ步：DNA变性（90°C-96°C):双链DNA模板在热作用下，氨键断裂，形成单链DNA;退火 (60°C-65°C):系统溫度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；延伸（70°C-75°C):在 Taq酶（在72°C左右，活性最佳）的作用下，W脱氧核糖核巧Ξ憐酸（dNT巧为原料，从引物 的3'端开始W从5' - 3'端的方向延伸，最终合成与模板互补的DNA链。每一循环经过 变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。 运用PCR技术检测主要设及到两个方面：核酸的提取和核酸的扩增检测。目前，国 内临床上主要采用煮沸法对B族链球菌的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涂，再加 裂解液，煮沸，高速离屯、，取上清为模板。步骤繁琐，而且各厂家浓缩和裂解效率差异较大， 样本依赖性强，对于较复杂的样本提取效率低。 巧光定量PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵 敏、更特异、更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后 病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了 污染。实时巧光定量PCR技术使用一种带有巧光检测装置的PCR扩增仪，巧光检测装置能够 按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测巧光信号，通过检测巧光信号 的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩 增曲线，根据扩增曲线与巧光阔值线的交点（即Ct值）W及扩增曲线的形状，可W判断阴 阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可w通过软件自动分析 获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反 应体系中增加了一条两端分别标记巧光报告基团和泽灭基团的探针。探针结构完整时，巧 光报告基团发出的巧光能量被泽灭基团吸收，呈现泽灭效应；如果扩增过程中有祀序列的 存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，巧光报告基团与泽灭基团相 互解离，阻断了二者间巧光能量转移效应，巧光报告基团发出的巧光信号被巧光检测装置 收集。随着扩增的进行，巧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可W 通过巧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可W获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果， 因此，该技术在祀多核巧酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十 分广泛的应用。研究显示，实时巧光PCR检测方法与标准的细菌培养方法在GBS检测的敏 感性和特异性方面均达90%W上，达到筛检标准，已经得到美国食品和药品管理局（抑A) 的批准并应用于临床。因此，在国内采用实时巧光PCR技术进行GBS筛检是最快速、可靠的 方法。 目前，国内已有数种基于实时巧光PCR技术检测B族链球菌-DNA的试剂盒应用于 临床检测中，运些试剂盒所提供的B族链球菌-DNA提取方法主要是煮沸法。在实际临床应 用中，此方法暴露出诸多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样 本时，经过煮沸裂解、高速离屯、富集DNA等多个步骤，DNA损耗严重，且对高浓度的样本存在 裂解和富集不充分的问题；2)同时由于采用了水浴或金属浴的高溫加热步骤，容易造成气 溶胶污染；3)检测灵敏度偏低，约在lOOOcopies/ml左右；4)没有设置阳性内对照（即内 标），无法监控假阴性。
技术实现思路
本专利技术提供一种B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，W解决现有技术中 试剂盒检测效果差、灵敏度低的问题。 本专利技术提供一种核酸释放剂在B族链球菌检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎 梵婷0.05-0.51111/1、氯化钟 100-3001111/1、十二烷基横酸钢0.05-3%和乙醇0.01-1%。 本专利技术还提供一种B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，所述B族链球菌 PCR巧光探针法核酸检测试剂盒包括：核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵 婷0. 05-0. 氯化钟100-300mM/l、+二烷基横酸钢0. 05-3%和乙醇0. 01-1% ;所述 PCR反应液包括用于祀多核巧酸扩增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸检测的探 针。 优选的，所述用于祀多核巧酸检测的探针序列为：5'-CAAATAACATTTCATATGTTATCT GGCAACAAAAGT-3^ 〇 优选的，所述用于祀多核巧酸扩增的上游引物和下游引物的序列分别为：上游引 物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3' ；下游引物：5' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒还包括内标，所述内标序 列为：5，-TTCTCAGCCTTCGCACGCGTATTACTCTTGTCACAGCGTCGTTTGCGGTCTGTGGTATGCACGAAGGTC TTTGAAGTTTGTGCTGTCTTCCATTCTCTGTCGTGCCATCT-3 >。 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒还包括用于内标片段扩 增的上下游引物和用于检测内标的探针，且所述检测内标的探针序列为：5' -ATTACTCTTGTC ACAGCGTCGTTTGCG-3'。[001引优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒中还包括酶混合液，所述 酶混合液中包括耐热DNA聚合酶和尿喀晚DNA糖基化酶，同时在所述PCR反应液中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核酸释放剂在B族链球菌检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷0.05‑0.5mM/L、氯化钾100‑300mM/L、十二烷基磺酸钠0.05‑3％和乙醇0.01‑1％。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，黄河，邓中平，易晓明，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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