本发明专利技术公开了一种用于结肠腺瘤样息肉蛋白（APC）基因突变检测的检测试剂、PCR检测方法及应用，属于基础生物研究及生物检测技术领域。检测试剂包括引物、肽核酸荧光探针及野生型互补的肽核酸序列，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1、NO.3；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2、NO.4；肽核酸荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5、NO.6；野生型互补肽核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7、NO.8。本发明专利技术从转录水平能快速发现Wnt信号通路中APC基因突变情况，具有特异性强、灵敏度高等显著优点，为抗癌药物筛选，新靶向药物探讨、基础科学研究提供工具。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于结肠腺瘤样息肉蛋白（APC）基因突变检测的检测试剂、PCR检测方法及应用，属于基础生物研究及生物检测
检测试剂包括引物、肽核酸荧光探针及野生型互补的肽核酸序列，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1、NO.3；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2、NO.4；肽核酸荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5、NO.6；野生型互补肽核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7、NO.8。本专利技术从转录水平能快速发现Wnt信号通路中APC基因突变情况，具有特异性强、灵敏度高等显著优点，为抗癌药物筛选，新靶向药物探讨、基础科学研究提供工具。【专利说明】一种结肠腺瘤样息肉蛋白APC基因突变检测试剂及应用
本专利技术涉及分子生物学及临床分子诊断
，具体涉及一种基于肽核酸探针 的结肠腺瘤样息肉蛋白APC基因突变检测试剂及应用。
技术介绍
Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高 度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程 中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信 号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt 信号通路，在经典通路即Wnt-P-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的 Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离0-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的 员-catenin蛋白水平升高后将发生0-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中0-catenin蛋白 升高，胞核中fcatenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxMl蛋白共同与TCF/LEF-1转录因 子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。 APC蛋白是Wnt信号通路中0-catenin上游重要成员之一。其主要作用是能够与 Axin2、GSK30、CKl等蛋白结合形成复合体，促进细胞质中0-catenin的降解。目前越来越多 的研究已经发现，在很多肿瘤中APC蛋白均呈现不同程度的突变。 目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达 水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段。近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，以及APC蛋 白作为Wnt信号通路重要成员其突变水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的 重要问题，尤其是在APC基因 Armadi 1 lo-associated结构域中发生的突变，对APC蛋白发挥 功能起着非常重要的作用，例如在结直肠腺癌细胞中检测出R876QS突变，肺腺癌细胞中检 测出S966G突变等。 肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA 类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的 第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代 了 DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的 形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA 之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的 杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远 优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现出很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶 和蛋白酶水解。 本方法采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的类 似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥 所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势， 大大提高了检测灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中如何确定Wnt信号通路中核心的信号分子APC基 因突变情况，以及如何解释核心分子APC在肿瘤细胞中的突变水平变化的困难，提供了一种 检测Wnt信号通路中APC基因突变检测试剂、PCR检测方法及应用。 本专利技术的目的是提供一种检测Wnt信号通路中结肠腺瘤样息肉蛋白APC基因突变 的检测试剂，包括用于阻断野生型APC基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增R876Q、 S966G突变型APC基因序列的一组引物对及突变型PNA荧光探针： 所述检测APC基因R876Q突变正向引物如序列表中SEQ ID N0.1; 所述检测APC基因R876Q突变反向引物如序列表中SEQ ID N0.2; 所述检测APC基因S966G突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.3; 所述检测APC基因S966G突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.4; 所述检测APC基因R876Q突变型PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5; 所述检测APC基因S966G突变型PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.6; 所述特异性结合包含APC基因876密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7; 所述特异性结合包含APC基因966密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8; 所述PNA荧光探针的5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3S 〇75,3'端的淬灭基团为 ：1410^4(311口86、8即1、8即2、8即3或048〇￥匕 本专利技术所述的检测试剂还包括PCR反应液、876密码子和966密码子突变型参考品、 876密码子和966密码子野生型参考品，其中PCR反应液包括:DEPC水、具有5 ' -3 '外切活性 的DNA聚合酶、dNTPs、10 X PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆转录酶、〇 1 igo (dT)和含Mg离子的溶 液。 所述876密码子突变型参考品为含SEQ NO.9的重组质粒DNA; 所述876密码子野生型参考品为含SEQ NO. 10的重组质粒DNA; 所述966密码子突变型参考品为含SEQ NO. 11的重组质粒DNA; 所述966密码子野生型参考品为含SEQ NO. 12的重组质粒DNA;所述具有5 ' -3 '外切活性的DNA聚合酶为Taq酶； 所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为：Taq酶0.01U/yL~ 0.05U/yL，dNTPs 0.2~0.6mM，10XPCR Buffer 1X，RNASIN 40U/yL~60U/yL，M-MLV逆转 录酶 200U/yL ~320U/yL，MgC12 1 ? 5~5 ? OmM，溶剂为 DEPC 水。 具体地，所述正向引物的终浓度为0.05~0.9yM，所述反向引物的终浓度为0.05~ 0.9虚，所述oligo(dT)终浓度为0.05~0.9處，所述互补PNA序列终浓度为0.05~0.9虚，所 述荧光探针的终浓度为〇. 05~0.9yM。本专利技术所述的试剂进行实时荧光定量PCR的反应程序为:42°C逆转录20min;94°C 预变性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测Wnt信号通路中结肠腺瘤样息肉蛋白APC基因突变的检测试剂，其特征在于，包括用于阻断野生型APC基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增R876Q、S966G突变型APC基因序列的一组引物对及突变型PNA荧光探针：所述检测APC基因R876Q突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；所述检测APC基因R876Q突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；所述检测APC基因S966G突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.3；所述检测APC基因S966G突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.4；所述检测APC基因R876Q突变型PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5；所述检测APC基因S966G突变型PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.6；所述特异性结合包含APC基因876密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7；所述特异性结合包含APC基因966密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8；所述PNA荧光探针的5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐景峰，周策凡，陈兴珍，张毅，秦文英，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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