用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用，通过对已经报道的保加利亚乳杆菌基因组序列的比对分析，本发明专利技术提供了用于保加利亚乳杆菌定性定量检测的引物5’-TCGAAATGCTGAATCTGCCTAA-3’、5’-TCGTCATCGTCTCTTCTGTAAACC-3’，同时本发明专利技术提供了一种饲料样品的预处理方法，使得饲料中的益生菌可以充分释放，准确真实的反应出饲料中的益生菌数目。本发明专利技术可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测猪饲料中保加利亚乳杆菌，检测程序简单、检测效率高、准确性好，灵敏度高，重复性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于畜牧兽医
更具体地，本专利技术涉及用于饲料中添加的保加利 亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用。
技术介绍
随着我国动物饲料中抗生素的禁用，新型的绿色添加剂的开发成为热点。目前益 生菌制剂不断发展，但是在其定性、定量检测的方法还不够科学和快速，这在一定程度上限 制了益生菌制剂的发展。通常采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的传统方 法，极易因为菌种差异导致的检测效率受限、检测结果不稳定，除此之外，传统方法也会耗 费大量的时间和资源。实时荧光定量PCR相对于PCR技术来说，是定性到定量的飞跃，因其 特异性强、重复性好、准确和高效的特点成为分子生物学和微生物学领域非常重要的定量 检测方法。通过种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立猪饲料中保加利亚乳杆菌 的快速定性、定量检测方法，可以提高检测效率、简化检测程序，并促进饲料行业和养殖业 的发展，为益生菌和饲料产业的快速和长远发展提供技术保障。 本申请针对猪饲料中含有的保加利亚乳杆菌，通过对已经报道的保加利亚乳杆菌 基因组序列的比对分析，选取保加利亚乳杆菌的保守基因作为目的基因，自行设计保加利 亚乳杆菌的基因序列的种属特异性引物，利用该引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量 PCR，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立了猪饲料中保加利 亚乳杆菌的快速定性和定量测定方法。
技术实现思路
用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物： 5' -TCGAAATGCTGAATCTGCCTAA-3'、5' -TCGTCATCGTCTCTTCTGTAAACC-3'。 本专利技术的另一个目的在于提供了用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、 定量检测试剂盒的检测方法，方法简单，重复性高，结果准确。 本专利技术的另一个目的在于提供了一种用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速 定性、定量检测试剂盒的应用。 为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施： 用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物： 5' -TCGAAATGCTGAATCTGCCTAA-3'、5' -TCGTCATCGTCTCTTCTGTAAACC-3'。 用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，包 括饲料样品预处理的方法，该方法包括： 经过充分粉碎混匀的饲料25g与225mL的灭菌生理盐水混合，在4°C以100转/分 的速度震荡l_2h，配成10%的均匀稀释液。对均匀稀释液进行10倍递增稀释，选择2个以 上适宜的稀释度，根据需要，提取细菌基因组DNA或RNA。 用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的应用，其应用 包括利用该试剂盒制备成用于保加利亚乳杆菌的检测试剂，或利用该试剂盒进行保加利亚 乳杆菌的定性检测，或利用该试剂盒进行保加利亚乳杆菌的定量检测，或利用该试剂盒同 时进行保加利亚乳杆菌的定性和定量的检测。 与现有技术相比，本专利技术具有以下优点： (1)本专利技术所采用的饲料样本的处理方法使得在益生菌的提取过程中，益生菌的 扩增有限，同时饲料中的益生菌又可以充分释放，这样所测得值才能真实的反应出饲料中 的益生菌数目，为一种特异的适用于饲料中保加利亚乳杆菌提取方法，为本专利技术首创。 (2)本专利技术对目前已经报道的保加利亚乳杆菌及饲料中可能添加的如嗜酸乳杆 菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、双歧杆菌等其他益生菌所有的基因组序 列进行了比对分析，选择了保守的单拷贝基因作为目的基因，并以该基因的保守序列设计 了特异性的引物，以该引物对饲料中的保加利亚乳杆菌进行定性、定量检测，所得到数据才 能真实的反应出饲料中添加的保加利亚乳杆菌的数量。 (3)本专利技术可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检 测猪饲料中保加利亚乳杆菌，整个过程对饲料中保加利亚乳杆菌的检测程序简单、检测效 率高、准确性好，灵敏度高，最低检测标准要比传统的方法低的多，而且重复性好。【附图说明】 图1为保加利亚乳杆菌的定性检测示意图。 M:DL2000marker;1 :干酪乳杆菌；2 :嗜酸乳杆菌；3:植物乳杆菌；4:屎肠球菌； 5:粪肠球菌；6:两歧双歧杆菌；7:动物双歧杆菌；8:阳性对照（含有目的基因的质粒为模 版）；9:保加利亚乳杆菌；10:添加有保加利亚乳杆菌的饲料；11:大肠杆菌；12阴性对照 图2为Real-timePCR对保加利亚乳杆菌引物特异性的验证示意图。 其中A.嗜酸乳杆菌B.植物乳杆菌C.保加利亚乳杆菌D.干酪乳杆菌E.粪肠球 菌F.屎肠球菌G.双歧杆菌H.青春双歧杆菌。 图3为不同浓度保加利亚乳杆菌标准菌种扩增曲线示意图。 其中A. 10 1稀释；B. 10 2稀释；C. 10 3稀释；D. 10 4稀释；E. 10 5稀释；F. 10 6稀释； G. 10 7稀释；H. 10 8稀释。 图4为保加利亚乳杆菌定量检测标准曲线示意图。【具体实施方式】 本专利技术实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所用试剂或 材料，均已公开。 pMD18-T克隆载体核DH5α感受态细胞均购自Takara生物科技有限公司，Trizol 试剂是由Invitrogen公司专供提取的RNA的产品；DNaseI是TaKaRa公司产品；此过程中 使用的氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂是天津市化学试剂三厂生产的产品。保加利亚乳杆菌 标准菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。 实施例1 : 保加利亚乳杆菌目的检测基因的选取： 本专利技术对目前已经报道的保加利亚乳杆菌及饲料中可能添加的如嗜酸乳杆菌、 干酪乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、双歧杆菌等其他益生菌 所有的基因组序列进行了大量比对分析，选择定性、定量检测的目的基因，该目的基因在 保加利亚乳杆菌基因组中是保守的看家基因，而且是单拷贝基因，以该基因的保守序列 设计了特异性的引物，对饲料中的保加利亚乳杆菌进行定性、定量检测，所得到数据才能 真实的反应出饲料中添加的保加利亚乳杆菌的数量。针对该目的基因设计的引物为： 5' -TCGAAATGCTGAATCTGCCTAA-3'、5' -TCGTCATCGTCTCTTCTGTAAACC-3' ；该引物可用于保加 利亚乳杆菌的定性及定量检测。 实施例2 : 用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物： 5' -TCGAAATGCTGAATCTGCCTAA-3'、5' -TCGTCATCGTCTCTTCTGTAAACC-3'。 实施例：3 : 用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，包 括饲料样品预处理的方法，该方法包括： 经过充分粉碎混匀的饲料25g与225mL的灭菌生理盐水混合，在4°C以100转/分 的速度震荡l_2h，配成10%的均匀稀释液。无菌操作对上一步制备的均匀稀释液进行10 倍递增稀释，选择2~3个以上适宜的稀释度，根据需要，提取细菌基因组DNA或RNA。 其余步骤利用实施例1中的引物对对提取的DNA或RNA进行定性和定量的鉴定。 用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于饲料中添加的保加利亚乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物：5’‑ TCGAAATGCTGAATCTGCCTAA ‑3’、5’‑ TCGTCATCGTCTCTTCTGTAAACC ‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，侯永清，赵迪，丁斌鹰，易丹，王蕾，陈洪波，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42