本发明专利技术公开了一种表达NAD(P)H氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。本发明专利技术是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1作为出发菌株，首先用强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，构建yodc表达盒，然后通过同源重组用上述yodc表达盒替换基因组上非必需区域skin，整合表达内源NAD(P)H氧化酶以再生NAD(P)+，调控胞内NAD(P)+/NAD(P)H比例，使胞内氧化还原水平更加有利于合成乙酰氨基葡萄糖。在使用半合成培养基的摇瓶发酵过程中，表达NAD(P)H氧化酶的重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖的产量达到7.1g/L，比整合表达前提高31％。为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种表达NAD(Ρ)Η氧化酶提高重组枯草芽抱杆菌乙酷氨基葡萄糖产 量的方法，属于遗传工程领域。
技术介绍
乙酷氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物W及 动物体内。在人体中，乙酷氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软 骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酷氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加 来治疗和修复关节损伤。此外，乙酷氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目 前，乙酷氨基葡萄糖主要采用酸解邮壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污 染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。 枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化 学品的生产宿主，其产品被FDA认证为"generallyregardedassafe" (GRA巧安全级别。 因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽抱杆菌是生产食品安全级乙酷氨基葡萄糖的有效 途径。
技术实现思路
本专利技术首先提供一种表达NAD(P)Η氧化酶的重组枯草芽抱杆菌，乙酷氨基葡萄糖 的产量提高。所述重组枯草芽抱杆菌WBSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNAl为出发菌株，同时整合表 达内源NAD(P)Η氧化酶。 阳0化]所述BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GMl，是WΒ.subtilisl68Δna评ΔgamPΔgamAΔnagA Δna浊Μ化Δpta: :lox72为宿主，分别W启动子PxyiA、P43控制glmS、GNAl的重组表达。 所述整合表达是W强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，通过同源 重组替换基因组上非必需区域skin。非必需区域skin在Bacillussubtilis168基因组NC_000964. 3 上的位置为 2654942-2701732bp。 阳007] 在本专利技术的一种实施方式中，重组枯草芽抱杆菌BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNAl的构 建方'法参见文南犬Liu,Y.etal.Modularpathwayen邑ineerin邑ofBacillussubtilisfor improvedN-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng. 23:42-52, 2014。 所述NAD(P)H氧化酶的编码基因yodc如NCBI-Gene10:939506所示。 本专利技术还提供一种构建所述重组枯草芽抱杆菌的方法，是 BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNA1为出发菌株，通过同源重组在基因组上W强启动子P43控制 NAD(P)Η氧化酶基因yodc表达。 本专利技术还提供了一种应用所述重组枯草芽抱杆菌发酵生产乙酷氨基葡萄糖的方 法，将37°C、20化pm下培养1化的种子W5%的接种量转入发酵培养基，于37°C、20化pm条 件下培养30h。 重组枯草芽抱杆菌种子培养及发酵： 种子培养基（g/L):膜蛋白腺10,酵母粉5,化C1 10。 发酵培养基（g/L):Glc60,酵母粉6,NH4SO47. 74,K2HPO4· 3&0 12. 5,KH2PO42. 5， CaC〇35，MgS〇43,微量元素 15ml/L。 微量元素溶液（g/L) :MnS〇4· 5&0 1. 0, C0CI2·6H2O 0. 4, NaMo〇4· 2&0 0. 2， ZnS〇4· 7&0 0. 2, Aids · 6&0 0. 1，Cuclz · &0 0. 1，H3BO40.0 5,含5M肥1。[001引培养条件：将37°C、20化pm下培养1化的种子W5%的接种量转入发酵培养基，于 37°(：、200巧111条件下培养30}1。 本专利技术用强启动子P43控制NAD(P)Η氧化酶基因yodc表达，构建yodc表达盒，然 后通过同源重组用上述yodc表达盒替换基因组上非必需区域skin,整合表达内源NAD(P) Η氧化酶W再生NAD(ΡΓ，调控胞内NAD(P) 7NAD(P)Η比例，使胞内氧化还原水平更加有利于 合成乙酷氨基葡萄糖。在使用半合成培养基的摇瓶发酵过程中，表达NAD(P)H氧化酶的重 组枯草芽抱杆菌乙酷氨基葡萄糖的产量达到7.Ig/L，比整合表达前提高31%。本专利技术为进 一步代谢工程改造枯草芽抱杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本专利技术提供的重组枯草芽抱 杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。【具体实施方式】 乙酷氨基葡萄糖的测定方法： 阳0化]高效液相色谱（册LC)检测法：Agilent1260,RID检测器，HPX-87H柱度io-Rad Hercules,CA)，流动相：5mMH2SO4,流速 0.6mL/min，柱溫 35°C，进样体积为 10μL。 实施例1构建yodc表达盒 参考 文南犬Genomeengineeringrevealslargedispensablere邑ions inBacillussubtilis.MolBiolEvol.2003Dec;20 (12) : 2076-90.化油 2003Aug29,同时 根据NCBI上公布的枯草芽抱杆菌度acillussubtilis168,购自美国典型微生物保藏中 屯、，ATCCNo. 27370)基因组序列，设计yodc表达盒同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别 为：yodc-skinA-F:5, -GGTCCCTCGATGATTATCACTTTCATAAAATGC-3,和yodc-skinA-R: 5 > -CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCGATTGCTGTAGCTGTTGGTGTATTTGGAATTC-3 > ; 右臂上下游引物分别为：yodc-skin-R-F: -CCGCTTTCAAAAGTATCAACTTGGCTGTAACTTAGACGCATTTTCCTATGAAAAAAGTCTTGATT TC-3' 和yodc-skin-R-R:5' -CGCTTTTCCTTCTCTGCCCGATAAAACT-3' ；运用上述引物从枯草芽 抱杆菌度acillussubtilis168)基因组中扩增yodc表达盒中包含的左臂和右臂。 根据NCBI-GeneID:939506所示NAD(P)Η氧化酶编码基因yodc序列，设计引物扩 增NAD(P)H氧化酶编码基因yodc,上下游引物分别为：P43-sk-yodc-F: 5，-CGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGACGAATACTCTGGATGTTTTAAAAGCA CG-3,和P43-sk-yodc-R: 阳0巧]5 >-GAAATCAAGACTTTTTTCATAGGAAAATGCGTCTAAGTTACAGCCAAGTTGATACTTTTGAAAGC GG-3';运用上述引物从枯草芽抱杆菌度acillussubtilis168)基因组中扩增yodc表达 盒中包含的NAD(P)Η氧化酶编码基因yodc。 根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列（NCBIaccessionno.抓541492)，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以BSGN6‑PxylA‑glmS‑P43‑GNA1为出发菌株，在基因组上整合表达内源NAD(P)H氧化酶；所述BSGN6‑PxylA‑glmS‑P43‑GNA1，是以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，堵国成，李江华，马文龙，武耀康，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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