基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术属于基因突变检测领域，尤其涉及利用Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法和试剂盒。为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法及试剂盒的不足,本发明专利技术提供了一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，由于在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点的特定连接引物体系，极大抑制了样品中的野生型EGFR基因片段的扩增，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本；或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别；本发明专利技术方法及试剂盒可以基于Sanger测序检测出样本中含量低至1%的EGFR基因突变，准确率极高，检测费用低廉并且还可能测出新的未知突变。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因突变检测领域，尤其涉及利用Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法和试剂盒。
技术介绍
人类表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR）是一种由原癌基因C-erbB-1(HER-1)编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，广泛表达于大部分正常上皮细胞中。然而在许多实体肿瘤（如非小细胞肺癌）中往往存在EGFR高表达或异常表达的情况，这与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡的抑制有关，因此EGFR已经成为相关肿瘤（尤其是非小细胞肺癌）靶向治疗的一个重要靶点。目前应用于临床的EGFR靶向药物包括:EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs,如吉非替尼即易瑞沙和厄罗替尼即特罗凯)，以及EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗。大量研究表明,吉非替尼（Gefitinib）和厄罗替尼（Erlotinib）的疗效与EGFR基因尤其是其18-21号外显子的突变状况密切相关。携带EGFR基因突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感，患者将得到很大的受益；反之野生型基因的患者将基本不受益，因此EGFR基因检测作为非小细胞肺癌等癌症靶向药物选用的前提被列入了最新的NCCN（美国国家综合癌症网络）肿瘤临床实践指南。目前报导的EGFR基因突变检测方法包括Sanger测序、Scorpions-ARMS、TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等,其中在临床和科研中较为常用的方法为Sanger测序法和Scorpions-ARMS(Scorpions，蝎形探针；Amplificationrefractorymutationsystem,扩增阻滞突变系统)法。基于Scorpions-ARMS法开发的如德国Qiagen公司的EGFR检测试剂盒，可同时检测EGFR基因的29种常见突变,具有灵敏度高（可测出低至1%水平的突变），操作简单，快速检测等优点；然而该类进口试剂盒检测成本过高（每份标本需3000-5000元）限制了其临床的推广和应用。Sanger测序法是基因突变/多样性检测的金标准，具有技术和平台成熟、结果准确和全面等优点，相比于Scorpions-ARMS法，检测费用低廉并且还能测出未知突变；然而Sanger测序法主要的不足在于检测灵敏度约10-20%左右（即突变基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠检出），这制约了其临床应用。由于体细胞突变组分只占临床等样本中的一部分，除此之外还可能存在大量的野生型基因，因此提高在大量正常基因背景中少量突变检测的灵敏性，是目前改进或者开发方法的关键。
技术实现思路
为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法及试剂盒的不足,本专利技术的目的之一在于提供一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒；本专利技术的另一个目的在于提供一种基于Sanger测序的灵敏检测人类EGFR基因突变的方法。由于本专利技术在EGFR基因特定片段的扩增体系中加入了耐热DNA连接酶和针对突变位点的连接引物，导致样品中的野生型EGFR基因片段的扩增将受到有效的抑制，而突变型的扩增则基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术首先涉及一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的引物，所述引物由扩增引物组和连接引物组组成，所述连接引物组的核苷酸序列如SEQ.IDNO.9-SEQ.IDNO.26所示。其次，本专利技术的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，是在EGFR基因片段扩增体系中加入了所述的连接引物组、耐热DNA连接酶及其缓冲液。更具体地，基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，具体步骤和本专利技术试剂盒相关内容如下：（1）样本采集和基因组DNA提取采集或取出待测生物样本如患者的肿瘤组织或外周血等，利用相应的试剂盒提取其基因组DNA。（2）EGFR基因特定片段扩增采用本专利技术试剂盒分别配制EGFR基因外显子组合的含连接酶扩增体系，一共需要配制5管；所配制的5管扩增体系除了扩增引物和连接引物不同外其余均相同，如表1所示：表1EGFR基因外显子扩增体系（25uL）同时配制对应的不含连接引物、耐热DNA连接酶缓冲液和耐热DNA连接酶这三种组分的对照扩增体系5管，体系配制参照表1，所缺组分添加量由灭菌去离子水替补，其余组份同对应的正常体系。共5管正常体系（含连接酶体系）和5管对照体系（不含连接酶体系）在基因扩增仪上进行EGFR基因片段的扩增，扩增条件均为：95℃预变性5-10min；94℃变性15-30s，50-53℃退火45-90s，72℃延伸1-2min，循环30-36次；72℃终延伸10-12min。（3）目的基因片段的割胶回收所有的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在0.5ug/ml的EB溶液中染色20min并用清水脱色后置于凝胶成像系统上拍照和分析。在对照体系成功扩增出目的基因片段的情况下，以DNAMarker条带为标准，选择正常体系中各外显子扩增产物浓度不低于10ng/uL的条带进行割胶，并用凝胶纯化试剂盒进行回收。（4）目的基因片段序列测定对于割胶回收产物，按照DNA片段测序的标准操作进行双向测序和分析，依据所有测序峰图最终分析目的基因片段的序列。（5）EGFR突变结果判定在对照体系正常扩增的情况下，如果正常体系中的各外显子扩增条带均无满足割胶回收的目的条带，则无需进行割胶回收及后续操作直接判定样品的EGFR基因检测结果为阴性即野生型；如果有满足割胶回收的目的条带，且双向测序结果显示为对应连接引物靶向的已知突变，则判定样品的EGFR基因检测结果为阳性即突变型,突变类型以实际测出的已知突变为准；如果双向测序结果均为同一未知差异位点，则需进一步判定样品的EGFR基因检测结果为新突变还是多态性，突变/多态性类型以实际测出的为准；如果双向测序结果均为野生型，则判定样品的EGFR基因检测结果为无法判断，需要重新测定；如果双向测序结果是一向为野生型一向为突变型，则判定样品的EGFR基因检测结果为无法判断，需要重新测定。其中，步骤（1）中样本的采集对象若为肿瘤患者则应在其充分知情同意的前提下进行；采集或取出的组织样本包括但不限定于新鲜组织、冰冻组织、甲醛浸泡组织和甲醛固定石蜡包埋组织切片，血液样本包括但不限定于新鲜血液、血浆和血清，其它生物样本包括但不限定于胸水、腹水和肿瘤脱落细胞，样本采集或取用量等取样要求和前处理按照对应的基因组提取试剂盒执行；提取样本基因组DNA后，利用琼脂糖凝胶电泳或吸亮度法评估其提取量（浓度）和纯度，需要保证EGFR基因片段的有效扩增：如基因组DNA的提取量不少于200ng，纯度以OD260/OD280在1.8-2.0之间为宜。其中，步骤（2）中采用的扩增试剂盒组分如表2所示：表2本专利技术扩增试剂盒组分...

【技术保护点】
一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的引物，其特征在于：所述引物由扩增引物组和连接引物组组成，所述连接引物组的核苷酸序列如SEQ.ID NO.9‑ SEQ.ID NO.26所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的引物，其特征在于：所述引物由扩增引物组和连接引物组组成，所述连接引物组的核苷酸序列如SEQ.IDNO.9-SEQ.IDNO.26所示。
2.一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是在EGFR基因片段扩增体系中加入了如权利要求1所述的连接引物组、耐热DNA连接酶及其缓冲液。
3.根据权利要求2所述的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、8条扩增引物、18条连接引物、耐热DNA连接酶和耐热DNA连接酶缓冲液；所述8条扩增引物其序列如SEQ.IDNO.1-SEQ.IDNO.8所示，其中SEQ.IDNO.1和SEQ.IDNO.2、SEQ.IDNO.3和SEQ.IDNO.4、SEQ.IDNO.5和SEQ.IDNO.6、SEQ.IDNO.7和SEQ.IDNO.8分别用于靶向第18、19、20、21号外显子片段的扩增；所述18条连接引物其序列如SEQ.IDNO.9-SEQ.IDNO.26所示，其中SEQ.IDNO.9和SEQ.IDNO.10靶向第18号外显子的3种突变位点，SEQ.IDNO.11和SEQ.IDNO.12靶向第19号外显子的19种突变位点，SEQ.IDNO.13-SEQ.IDNO.22靶向第20号外显子的5种突变位点，SEQ.IDNO.23-SEQ.IDNO.26靶向第21号外显子的2种突变位点。
4.根据权利要求3所述的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/uL，具有耐热性能；所述PCR缓冲液是由pH=8.3的100mmol/LTris-HCl、500mmol/LKCl和15mmol/LMgCl2组成；所述dNTPs是由dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L混合而成的；所述扩增引物的浓度均为10umol/L；所述连接引物的浓度均为10umol/L；所述耐热DNA连接酶的酶活力单位浓度不低于4000U/uL，在正常体系下95度保温1h酶活力不低于原酶活的60%；所述耐热DNA连接酶缓冲液的配制为20mMTris-HCl、25mM乙酸钾、10mM乙酸镁、1mMNAD、10mMDTT、0.1%TritonX-100，pH=7.6。
5.一种利用权利要求2-4中任一项所述试剂盒的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法，其特征在于所述方法的步骤如下：
（1）样本采集和基因组DNA提取：采集或取出待测生物样本，利用商品化的试剂盒提取其基因组DNA；
（2）EGFR基因特定片段扩增：采用所述试剂盒分别配制EGFR基因外显子组合的扩增体系5管；每管扩增体系除了扩增引物和连接引物不同外其余均相同，引物包括以下组合：第1管体系包含SEQ.IDNO.1-SEQ.IDNO.2和SEQ.IDNO.5-SEQ.IDNO.6这两对扩增引物以及SEQ.IDNO.9-SEQ.IDNO.10和SEQ.IDNO.13-SEQ.IDNO.14这两对连接引物；第2管体系包含SEQ.IDNO.3-SEQ.IDNO.4和SEQ.IDNO.5-SEQ.IDNO.6这两对扩增引物以及SEQ.IDNO.11-SEQ.IDNO.12和SEQ.IDNO.15-SEQ.IDNO.16这两对连接引物；第3管体系包含SEQ.IDNO.5-SEQ.IDNO.6这一对扩增引物和SEQ.IDNO.17-SEQ.IDNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志清，施纯玫，郑建伟，陈强，翁芳霞，王劲，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建;35