携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞、间充质干细胞及制备方法。该方法包括：(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN，使所述WRN丧失功能，得到所述WRN功能丧失的人多能干细胞；(2)对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞。本发明专利技术所提供的多能干细胞衍生的间充质干细胞能够用于建立筛选WS治疗药物的药物筛选平台，同时也为延缓自然衰老的过程提供了更多的线索。

【技术实现步骤摘要】
携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞及制备方法
本专利技术属于生物
，涉及一种携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞及制备方法。
技术介绍
人口老龄化是世界尤其是中国面临的日益严峻的社会问题。毋庸置疑，衰老及其相关疾病已成为国内外科研领域急需突破的热点问题。模式生物的局限性使其无法在理论和实践层面上应用于人类衰老的基础研究及临床转化，因此新的人类衰老研究模型亟待产生。人类“早衰症”的发现使在实验室内研究人类衰老成为了可能。作为一种极端罕见的先天性遗传疾病，早衰症主要表现为机体的过早过快衰老，同时伴随发生老年群体所患的多种疾病，是人类群体中存在的具备加速老化特征的天然“突变体”。对早衰症疾病进程、并发症及分子机理的研究是揭示人类正常衰老过程及机制的重要途径和突破口。根据发病年龄，早衰症可分为儿童早衰症和成年早衰症。成年早衰症以Werner综合症(WernerSyndrome，WS)为代表，其致病原因是编码DNA损伤修复相关蛋白(Wernersyndromeprotein,WRN)的基因发生突变。与儿童早衰症相比，WS能够表现出更多的与人类自然衰老近似的表型和症状，因此作为更接近于人类自然衰老的早衰症模型而倍受关注。WS累及全身几乎所有组织与器官，而伴随人类自然衰老进程发生的特征都会在WS个体中加速体现。WS患者在青春期后就会提前出现一系列明显的机体衰老特征，包括：①身材矮小、面容皱缩、头发变白脱落、皮肤萎缩硬化和色素沉积；②心力衰竭、心肌梗塞等心脏疾病；③动脉粥样硬化与高血压；④胰岛素抵抗的高血糖、高血脂和高尿酸血症；⑤智力衰退与脑萎缩；⑥早发眼部退变；⑦免疫系统异常，易引发类风湿疾病等自身免疫病；⑧骨质疏松、关节畸形和运动受限。非常值得注意的是，WS患者易发生各类肿瘤，尤其是中胚层来源的肿瘤、黑素瘤和星形胶质细胞瘤等，这与老龄化和肿瘤发病率正相关的事实非常相符。WS患者的平均寿命为50岁，大多死于血管疾病与肿瘤。由于WS的临床表征同自然衰老过程非常类似，且表现出大多数生理性衰老相关的疾病类型，因此被认为是研究人类生理性衰老的最合适模型。通过对WS发病机理的研究将有利于认识正常衰老过程，揭示延缓衰老或治疗衰老相关疾病的重要靶点，为衰老从基础研究向临床转化提供重要的理论基础。有趣的是，最近研究表明人体组织的WRN蛋白表达随着年龄增高而出现逐渐降低的趋势，提示WRN的下调可能是正常衰老的重要作用。因此，研究WRN同人类衰老之间的关系，揭示人类成年早衰症的致病机理，将对于我们理解认识正常衰老过程及其揭示衰老相关疾病的病因具有重要的启示作用。WRN蛋白包含4个结构域，分别为3′→5′核酸外切酶结构域、RecQDNA解旋酶结构域、RQC结构域及HRDC结构域。人类WS相关的WRN突变包括多种形式，多为错义突变、剪接突变和移码框突变。目前所知的所有疾病相关的58种WS突变均可导致一个共同的结果，即引起WRN蛋白表达的下调或缺失。最近的生物化学及细胞生物学研究表明WRN在DNA复制、DNA损伤修复以及端粒和染色体的稳定性维持等方面均起着重要的作用。近年来，诱导多能干细胞(InducedPluripotentStemCell，iPSC)技术的出现和发展为血液疾病的基因治疗和细胞治疗提供了广阔前景。iPSC是通过将特定转录因子(如OCT4，SOX2，KLF4，cMYC等)导入体细胞，使其转变成为的具备胚胎干细胞特性的细胞。iPSC并非源于胚胎组织，不会受到伦理问题的限制；其次现有的基因打靶技术允许针对患者自体来源的iPSC进行基因突变的基因组原位矫正，从而在基因水平清除内源性致病因素；此外患者自体来源的iPSC，避免了配型和排斥反应的困扰，以上三点均体现了iPSC在个性化治疗和转化医学中巨大的应用前景。然而与其他遗传性疾病相比，WS患者的体细胞重编程研究具有更大的困难和挑战性。已有研究表明，WS患者皮肤成纤维体细胞经体外培养后提前发生老化并伴随严重的染色体异常，而重编程过程中又会进一步引发活性氧(ROS)增加、DNA断裂和细胞死亡(Senescence)等细胞事件严重阻碍体细胞重编程的过程，因此针对WS患者携带致病突变细胞的体细胞重编程研究困难重重，国内外未见成功实施的案例。近年来人胚胎干细胞(hESC)基因打靶技术的发展为在实验室内模拟和研究人类衰老和疾病带来了新的曙光。对于已明确遗传背景的人类疾病，生物医学家可以通过基因打靶技术向人hESC基因组的特定位置靶向引入相应的遗传突变，从而在实验室中创造出“疾病特异hESC”，进而通过定向分化技术，可研究疾病特异基因突变对特定组织细胞类型的影响。由此可见，现有报道均未产生WS的多能干细胞，并利用产生的WS-PSC有效模拟疾病表型，建立药物筛选平台，因而未能开展高效的药物筛选工作。综上所述，目前急需一种体外产生WS-PSC的安全高效技术，以及利用该WS-ESC及其衍生细胞产生高效高通量的药物筛选平台。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种间充质干细胞的制备方法。本专利技术所提供的间充质干细胞的制备方法，可包括：(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN(基因组序列为GenBank：NC_000008.11的第31033262-31173761位，updatedon21-Mar-2015；cDNA序列为GenBank：NM000553.4，updatedonPRI15-MAR-2015)，使所述WRN丧失功能，得到所述WRN功能丧失的人多能干细胞；(2)对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞。步骤(1)中，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN为缺失所述人多能干细胞中的所述WRN的第15外显子和第16外显子。步骤(1)中，缺失所述人多能干细胞中的所述WRN的第15外显子(GenBank：NM_000553.4的第2509-2617位，updatedonPRI15-MAR-2015)和第16外显子(GenBank：NM_000553.4的第2618-2686位，updatedonPRI15-MAR-2015)，具体是按照包括如下步骤的方法实现的：(a1)将序列表中序列1所示DNA片段(失活突变的WRN基因片段)的第11308-12850位构建到辅助腺病毒载体上，获得重组载体；在本专利技术中，序列1的第1-21236位通过与所述辅助腺病毒载体同源重组的方式构建得到所述重组载体。序列表中序列1共由21236个核苷酸组成，第1-11307位为上游同源臂；第11308-12850位为插入替换所述WRN第15外显子和第16外显子的Neo抗性基因表达框；第12851-21236位为下游同源臂。(a2)用所述重组载体转染腺病毒包装细胞，将所得细胞记为重组细胞1；用辅助腺病毒感染所述重组细胞1，将所得细胞记为重组细胞2；(a3)培养所述重组细胞2，从培养上清中获得重组腺病毒；(a4)用所述重组腺病毒感染所述人多能干细胞，从而获得所述WRN的第15外显子和第16外显子缺失的人多能干细胞。其中，用所述重组腺病毒感染所述人多能干细胞后，还包括用G418和Ganciclovir进行克隆筛选的步骤；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种间充质干细胞的制备方法，包括：(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN，使所述WRN丧失功能，得到所述WRN功能丧失的人多能干细胞；(2)对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的制备方法，包括：(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN，使所述WRN丧失功能，得到所述WRN功能丧失的人多能干细胞；(2)对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN为缺失所述人多能干细胞中的所述WRN的第15外显子和第16外显子。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，缺失所述人多能干细胞中的所述WRN的第15外显子和第16外显子，是按照包括如下步骤的方法实现的：(a1)将序列表中序列1的第11308-12850位所示DNA片段构建到辅助腺病毒载体上，获得重组载体；(a2)用所述重组载体转染腺病毒包装细胞，将所得细胞记为重组细胞1；用辅助腺病毒感染所述重组细胞1，将所得细胞记为重组细胞2；(a3)培养所述重组细胞2，从培养上清中获得重组腺病毒；(a4)用所述重组腺病毒感染所述人多能干细胞，从而获得所述WRN的第15外显子和第16外显子缺失的人多能干细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述辅助腺病毒载体为pCIHDAdGT8-4载体。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述辅助腺病毒为AdHPBGF35病毒。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述腺病毒包装细胞为人胚胎肾细胞293系的衍生细胞系116细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光慧，张维琦，曲静，任若通，汤富酬，铃木敬一郎，胡安·卡洛斯·伊斯毕华·贝尔蒙特，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11