本发明专利技术提供一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含检测第20号外显子T790M突变的引物探针序列的PCR反应液，其中其上游引物TM-F、下游引物TM-R和探针TM-P的序列分别为：TM-F：5'-CCACCGTGCAGCTCGTTAT-3'，TM-R：5'-AGCAGGTACTGGGAGCCAATA-3'，TM-P：5'-CAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC-3'。本发明专利技术提供的试剂盒在100ng/反应的野生型人DNA背景下无扩增信号，不出现假阳性情况，说明本发明专利技术试剂盒的特异性好、抗干扰能力强。应用该试剂盒，可以对临床石蜡切片等样本中的人EGFR基因突变进行快速检测，为诊断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含检测第20号外显子T790M突变的引物探针序列的PCR反应液，其中其上游引物TM-F、下游引物TM-R和探针TM-P的序列分别为：TM-F：5'-CCACCGTGCAGCTCGTTAT-3'，TM-R：5'-AGCAGGTACTGGGAGCCAATA-3'，TM-P：5'-CAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC-3'。本专利技术提供的试剂盒在100ng/反应的野生型人DNA背景下无扩增信号，不出现假阳性情况，说明本专利技术试剂盒的特异性好、抗干扰能力强。应用该试剂盒，可以对临床石蜡切片等样本中的人EGFR基因突变进行快速检测，为诊断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。【专利说明】一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒
本专利技术提供一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒。
技术介绍
EGFR(epidermal growth factor receptor)即表皮生长因子受体，是一种跨膜受 体酪氨酸激酶，正常情况下包埋在细胞表面的细胞膜中，是一种对肿瘤细胞的繁殖、生长、 修复和存活等起重要作用的膜蛋白。一般认为该酪氨酸激酶区域的激活即磷酸化对癌细胞 增殖、生长的相关信号传递很重要。基于这个观点，EGFR作为癌症治疗的分子靶标受到普 遍关注，并陆续开发出了 EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI)和抗EGFR抗体等。 异常的EGFR活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迀移、分化、血管新生，并且能够抑制 肿瘤细胞的凋亡。异常的EGFR活化机制包括受体本身的扩增、受体配体的过表达、活化突 变以及负性调节途径的缺乏。EGFR诱导癌症至少通过3种机制：EGFR配体的过表达、EGFR 的扩增或EGFR的突变活化。其中以EGFR的突变活化为主要机制。各项研宄也表明EGFR在 多种肿瘤细胞中存在突变或扩增的情况。已经检测到的突变数量最多的是非小细胞肺癌。 在癌症治疗中，传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患 者带来较大的毒副作用。因此，选择特异的分子靶点进行治疗日益受到人们的重视。在取 得明显疗效的同时，又可以避免对正常细胞的伤害。EGFR是目前国内外研宄者公认的一个 肿瘤靶向治疗分子。目前靶向EGFR的药物主要有两类：一类是作用与EGFR胞外区的单克 隆抗体，这类抗体能与EGFR胞外配体结合部位结合，阻断了 EGFR其与配体的结合，从而阻 断下游信号转导途径；一类是作用与胞内酪氨酸激酶活性区域的小分子酪氨酸激酶抑制剂 (tyrosine kinase inhibitor，TKI)，如 gefitinib 和 erlotinib。酪氨酸激酶抑制剂主要 为小分子喹啉类化合物，能够与细胞内酪氨酸激酶结构域上ATP位点竞争性结合，可逆性、 选择性抑制EGFR相关的酪氨酸激酶活性及细胞内磷酸化过程，进而抑制EGFR下游的信号 转导，从而阻断EGFR诱导的体外肿瘤细胞的生长，加速细胞凋亡、拮抗血管生成、抑制肿瘤 转移、阻断肿瘤生长。 目前FDA已经批准的作用于EGFR的靶向药物包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂 (EGFR-TKI)，例如吉非替尼（易瑞沙，阿斯利康制造）和厄洛替尼（特罗凯，罗氏制造）。临 床应用表明，EGFR-TKI仅对部分病人有效，进一步研宄发现，EGFR基因外显子18,19, 21突 变是EGFR-TKI靶向药物起作用的前提条件；而外显子20Ins/T790M突变是造成继发耐药的 主要原因。因此，专家推荐在使用EGFR-TKI靶向药物之前进行EGFR基因外显子20的突变 检测有助于提高用药的针对性，避免不必要的损失。 随着人类医学和药物研宄水平的提高，药理遗传学（Pharmacogenetics)日渐兴 起。研宄表明，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在 个体差异，受患者基因背景的影响。因此，应用药理遗传学，在基因水平上研宄药物作用的 个体差异，使得个性化治疗这一新一代医学概念成为可能。对药物作用相关基因的检测，可 指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。 随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测人EGFR基 因突变，主要包括测序、基因芯片、探针杂交技术等。而随着FQ-PCR技术的发展，其在人 EGFR基因突变诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，人EGFR基因突变的 实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越 性。 而基于荧光PCR技术与等位基因特异性PCR技术（ARMS-PCR)结合检测人EGFR基 因突变的方法被越来越多的研发人员尝试使用。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速 的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照 一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动 态变化实时反映 PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲 线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性 结果。等位基因特异PCR(ARMS-PCR)的基本原理是，TaqDNA聚合酶缺少3 - 5外切酶活性， 在一定条件下PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当 的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。 国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术与ARMS-PCR技术检测人EGFR基因突变 的试剂盒应用于临床检测中，然而此方法有很多不足之处：1)对于野生型背景的耐受能力 差，例如仅能耐受IOng野生型核酸的干扰，且经常出现假阳性；2) -般没有设置阳性内对 照（即内标），无法监控假阴性；3) -般没有预防PCR产物污染的措施。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒的缺陷，提供一 种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂 盒，应用该试剂盒，可以对临床石蜡切片等样本中的人EGFR基因突变进行快速检测，为诊 断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。 因此，本专利技术提供一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含 检测第20号外显子T790M突变的引物探针序列的PCR反应液，其中其上游引物TM-F、下游 引物TM-R和探针TM-P的序列分别为： TM-F : 5' -CCACCGTGCAGCTCGTTAT-3'， TM-R : 5'-AGCAGGTACTGGGAGCCAATA-3'， TM-P :5'-CAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC-3'。 本专利技术提供的试剂盒在IOOng/反应的野生型人DNA背景下无扩增信号，不出现假 阳性情况，说明本专利技术试剂盒的特异性好、抗干扰能力强。 优选地，所述试剂盒中还包含检测第20号外显子中三种插入突变的引物探针序 列的PCR反应液，检测每种插入突变的PCR反应液中均包含上游引物序列、下游引物序列和 探针各一条，其中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含检测第20号外显子T790M突变的引物探针序列的PCR反应液，其中其上游引物TM‑F、下游引物TM‑R和探针TM‑P的序列分别为：TM‑F：5'‑CCACCGTGCAGCTCGTTAT‑3'，TM‑R：5'‑AGCAGGTACTGGGAGCCAATA‑3'，TM‑P：5'‑CAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC‑3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，吴康，龙凤英，高堂杰，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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