本发明专利技术公开了一种用于DPP-4检测的多肽及包含该多肽的荧光探针。该荧光探针由特异性识别DPP-4的多肽与聚集诱导发光分子连接而成，多肽的氨基酸序列为：谷氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸，聚集诱导发光分子与多肽中的赖氨酸相连。由于多肽N端第二位含有脯氨酸，使得该荧光探针中的多肽能被DPP-4特异性识别，切断该多肽；该荧光探针本身基本无荧光吸收，但当其失去N端二肽时，则会产生明显的荧光吸收，从而能对DPP-4活性进行特异性的实时检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种用于DPP-4检测的多肽及包 含该多肽的荧光探针。
技术介绍
肠促胰岛素（incretin)是一类在肠道生成的具有促胰岛素分泌作用的多肽类激 素，它不仅能刺激胰岛素分泌，还有抑制餐后胰高血糖素分泌、延缓肠排空、抑制食欲、增强 胰岛素敏感性等作用。肠促胰岛素包括了胰高血糖素样肽-I(GLP-I)和葡萄糖依赖性促胰 岛素分泌多肽（GIP)，二者对促进胰岛素释放及胰腺外调节胰岛素水平显示出诸多优点。然 而GLP-I和GIP在体内很快被DPP-4水解，且水解产物影响其生理功能的发挥，使得二者无 法在临床上得到很好的应用。 DPP-4是一种丝氨酸肽酶，可特异性识别肠促胰岛素 N端第二位的脯氨酸 (proline)或丙氨酸（alanine)，并切断N端2个氨基酸，使肠促胰岛素失活，从而影响肠促 胰岛素的生理作用，进而影响糖尿病的发生发展。研究表明，DPP-4活性与糖尿病的发生发 展有着密切关系，DPP-4抑制剂可降低DPP-4的催化活性，抑制肠促胰岛素水解，从而提升 肠促胰岛素的浓度，取得改善血糖、保护β细胞功能的效果。目前常用的DPP-4抑制剂筛选方法有以甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4甲基香豆素 为底物的荧光底物法和以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺为底物的发色底物法。由于这些方法 对反应时间、样品处理要求较高，需反复验证或通过其它方法相互验证，难以直接测定得到 DPP-4活性，而且这些方法均不能用于DPP-4的细胞实时成像研究。 近年来，具有聚集诱导发光（Aggregation-induced emission, ΑΙΕ)效应的焚光 探针逐渐兴起，这类探针可有效地避免传统荧光材料存在的聚集态荧光减弱甚至猝灭的现 象，为设计高荧光量子产率的固态材料提供了一种新思路。 申请号为201510108446. 0的专利文献公开了一种具有聚集诱导发光特性的荧光 探针及其制备方法和应用。该荧光探针由特异性识别SIRTl蛋白的多肽与聚集诱导发光分 子连接而成，多肽的氨基酸序列为：甘氨酸-乙酰化赖氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-天冬氨 酸，聚集诱导发光分子与多肽中的甘氨酸相连。由于多肽的特定位置上含有乙酰化赖氨酸， 使得该荧光探针中的多肽能被SIRTl蛋白特异性识别，从而SIRTl蛋白对该多肽进行去乙 酰化修饰；该荧光探针本身基本无荧光吸收，但当其失去赖氨酸上的乙酰基时，则会产生明 显的荧光吸收，进一步地利用内切酶从赖氨酸位置将多肽剪断时，其荧光吸收强度进一步 增强，从而能对SIRTl蛋白活性进行特异性的实时检测。目前尚未见能特异性地识别DPP-4并对其进行活性检测的AIE荧光探针的相关报 道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于DPP-4检测的多肽以及包含该多肽的荧光探针，利用该荧 光探针可以特异性识别DPP-4并对其进行活性检测。 -种多肽，所述多肽的氨基酸序列为：EPFK。由于多肽N端第二位含有脯氨酸，能 被DPP-4特异性识别，从而能使DPP-4水解该多肽。 一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针，由上述多肽与聚集诱导发光分子连接而 成，所述聚集诱导发光分子与所述多肽中的赖氨酸相连。 本专利技术的荧光探针以聚集诱导发光分子为母核，母核上连接亲水性的多肽，从而 形成能特异性检测DPP-4的荧光探针。该荧光探针本身荧光很弱，但当其N端二肽被切断 时，则会产生明显的荧光吸收，从而能对DPP-4活性进行特异性的实时检测。 作为优选，所述聚集诱导发光分子包含由至少一个四苯乙烯分子构成的基本骨 架。当基本骨架中含有多个四苯乙烯分子时，多个四苯乙烯分子之间通过分子间相互作用 聚集。 作为优选，所述荧光探针的结构式如式（I )所示： 本专利技术还提供了一种所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤： (1)通过固相多肽合成反应合成上述的多肽； (2)以4-羟基二苯酮和二苯酮为原料制备化合物A : 具体地，步骤（2)包括：4_羟基二苯酮与二苯酮以四氢呋喃为溶剂在锌粉与四氯 化钛催化下加热回流（85°C )发生麦克默里反应，经硅胶色谱分离制备得到化合物A。 (3)在碳酸盐存在下，利用卤代乙酸乙酯与化合物A进行取代反应，获得化合物 B ： 碳酸盐作为催化剂夺取化合物A酚羟基上的氢离子，以便使该氢离子能更快更容 易地与卤代乙酸乙酯反应，若缺失碳酸盐，反应将会进行得十分缓慢。 作为优选，碳酸盐可选用碳酸钾或碳酸钠。 作为优选，化合物A、卤代乙酸乙酯、碳酸盐的摩尔比为I :1. 2~I. 4 :1. 2~1. 4， 在100~120°C之间回流24h进行取代反应。 (4)对化合物B进行还原获得化合物C : 作为优选，利用氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂等强碱对化合物C进行还原。 反应时，将化合物B先溶于四氢呋喃中制成B溶液（浓度为0.074mol/L~ 0. 082mol/L)，强碱先溶于水中制成强碱溶液（浓度为3. 6mol/L~4. Omol/L)，然后B溶液 与强碱溶液在四氢呋喃环境下混合反应，混合比例优选为2. 2~2. 3 :1 (v/v)。 (5)利用步骤⑴所述的多肽与化合物C进行固相多肽合成反应，获得如式（I ) 的荧光探针。 化合物C中的羧基与多肽中赖氨酸的氨基发生脱水缩合反应，获得本专利技术的荧光 探针。 本专利技术还提供了所述荧光探针在DPP-4活性检测中的应用。 本专利技术还提供了所述荧光探针在DPP-4抑制剂筛选中的应用。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果为： 本专利技术的荧光探针能够特异性地识别DPP-4,DPP-4能特异性地切断荧光探针中N 端的谷氨酸-脯氨酸，从而使本身基本无荧光吸收的荧光探针在450nm下产生明显的荧光 吸收，实现对DPP-4活性的特异性检测，还能进一步用于筛选DPP-4抑制剂。【附图说明】 图1为本专利技术一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针的合成流程图。 图2为实施例1中化合物C和荧光探针的荧光光谱分析结果图，其中，TPE-COOH表 示化合物C，TPE-KFPE表示荧光探针。 图3为实施例2中荧光探针检测DPP-4活性的荧光光谱分析结果图。 图4为本专利技术荧光探针检测DPP-4的原理图。 图5为抑制剂浓度与其对DPP-4抑制效应的量效关系图。 图6A为在DPP-4抑制剂存在下荧光探针染色后的细胞荧光图像； 图6B为在DPP-4抑制剂存在下经荧光探针染色后细胞的相对荧光强度检测结 果； 其中，Control (正常组）为正常3T3-L1前脂肪细胞，抑制剂组为Diprotin A刺 激的3T3-L1前脂肪细胞。 图7为荧光探针对DPP-4的检测灵敏度考察结果。 图8为与其他蛋白相比，荧光探针对DPP-4的胞外检测特异性考察结果，其中， (1-1。) /1。表示（样品荧光值-本底荧光值）/本底荧光值。 图9为荧光探针对细胞毒性测试结果。【具体实施方式】 下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步详细说明。 实施例1具有AIE特性的荧光探针合成 本实施例一种具有AIE特性的荧光探针的合成方法，其合成流程如图1所示，包 括： (1)通过固相多肽合成反应单独合成多肽链，多肽链的序列为谷氨酸-脯氨酸-苯 丙氨酸-赖氨酸； (2)将 4-羟基二苯酮（I. 9g，IOmmol)与二苯酮（2. 2g本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：EPFK。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程翼宇，王毅，赵筱萍，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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