经由镁螯合的PCR热启动制造技术

本发明专利技术涉及经由镁螯合的PCR热启动。具体地，本发明专利技术涉及具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽。根据本发明专利技术的此种肽是用于核酸扩增的组合物的部分且提供所谓的热启动效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过执行聚合酶链反应方法(PCR)扩增核酸的
更精确地，本专利技术提供了用于执行PCR的新型热启动替代方案，这防止非特异性的引发事件和假扩增产物的产生。
技术介绍
伴随核酸扩增和更特别地伴随PCR的主要问题是非特异性扩增产物的产生。在许多情况下，这是由于在其实际的热循环程序前的非特异性寡核苷酸引发和随后的引物延伸事件，因为耐热的DNA聚合酶在环境温度下也是适度活性的。例如，经常观察到由于最终由偶然发生的引物二聚化和后续延伸的扩增产物。为了克服这个问题，本领域众所周知的是进行所谓的“热启动” PCR，其中扩增反应所需的一种组分与反应混合物分开或维持无活性状态，直至反应混合物的温度首次升高。因为聚合酶在这些条件下不起作用，所以在引物无一可以特异性结合的时间段期间不存在引物延伸。为了达到这种作用，已应用几种方法:a) DNA聚合酶的物理分离物理分离可以例如通过固体蜡的屏障来获得，所述固体蜡使包含DNA聚合酶的区室与包含大量其他试剂的区室分开。在第一个加热步骤期间，蜡随后自动熔化且流体区室混合(Chou，Q.，等人，Nucleic AcidsRes20 (1992) 1717_23，US5, 411，876)。可替代地，在扩增反应前，DNA聚合酶被亲和固定化在`固体支持体上，并且仅通过热介导的释放而释放到反应混合物内(Nilsson, J.,等人,Biotechniques22 (1997) 744-51)。然而,这两种方法是费时的且不便于执行。b) DNA聚合酶的化学修饰对于这种类型的热启动PCR，DNA聚合酶由于化学修饰而可逆地灭活。更精确地，将不耐热的封闭基团引入Taq DNA聚合酶内，这使得酶在室温下无活性(US5，773，258)。这些封闭基团在高温下在前PCR步骤期间被去除，从而使得酶变得活化。此种不耐热的修饰例如可以通过使朽1康酐或乌头酐(Aconitric Anhydride)与酶的赖氨酸残基偶联来获得(US5，677，152)。携带此种修饰的酶同时是作为Amplitaq Gold(Moretti，T.，等人，Biotechniques25(1998)716-22)或 FastStart DNA 聚合酶(Roche MolecularBiochemicals)商购可得的。然而，封闭基团的引入是在酶所有空间可利用的赖氨酸残基上任意发生的化学反应。因此，化学修饰的酶制剂的再现性和品质可能有变化且几乎不能加以控制。c) DNA聚合酶的重组修饰Taq聚合酶的冷敏感突变体已借助于基因工程进行制备。这些突变体不同于野生型酶之处在于它们缺乏N末端(US6，241，557)。与天然或野生型重组Taq聚合酶形成对t匕，这些突变体在35°C下是完全无活性的，且因此它们可以在一些情况下用于执行热启动PCR0然而，N末端截短的冷敏感突变体形式需要低盐缓冲液条件，与野生型酶相比较具有较低的持续合成能力且因此仅能用于扩增短靶核酸。此外，因为截短形式缺乏5' -3'外切核酸酶活性，所以它不能用于基于TaqMan检测形式的实时PCR实验。d)经由核酸添加剂的DNA聚合酶抑制非特异性退火的引物延伸已显示通过添加短双链DNA片段得到抑制(Kainz，P.，等人，Biotechniques28 (2000) 278-82)。在这种情况下，引物延伸在低于短双链DNA片段的解链温度的温度下得到抑制，但不依赖对照模板(Competitor)DNA自身的序列。然而，过量的对照模板DNA影响核酸扩增反应产量的程度是未知的。可替代地，可以使用具有导致限定的二级结构的特定序列的寡核苷酸适体。此种适体已使用SELEX技术就对DNA聚合酶的极高亲和力进行选择(US5，693，502，Lin, Y.和Jayasena, S.D., J Mol Biol271 (1997) 100-11)。在实际热循环过程自身前扩增混合物内此种适体的存在再次导致与DNA聚合酶的高亲和力结合和随后其活性的不耐热抑制(US6, 020, 130)。然而，由于选择过程，迄今为止的所有可利用的适体仅能与一个特定种类的DNA聚合酶组合使用。e)Taq DNA 抗体达到Taq DNA聚合酶的不耐热抑制的替代方法是添加针对纯化的酶产生的单克隆抗体(Kellogg, D.E.，等人，Biotechniquesl6 (1994) 1134-7 ； Sharkey, D.J.，等人，Biotechnology (NY) 12 (1994) 506-9)。如同寡核苷酸适体,抗体与Taq DNA聚合酶在环境温度下以抑制方式以高亲和力结合(US5，338，671)。复合物在热循环过程自身前的预热步骤中分解。这导致总体上扩增的基本上费时的延长，特别是如果应用用于快速热循环的规程(W097/46706)。US5，985，619公开了使用热启动抗体用于执行PCR的具体实施方案，其中除Taq聚合酶外，将例如来自大肠杆菌(E.coli)的外切核酸酶III作为补料加入扩增混合物内，以消化非特异性引物二聚体中间物。如上文公开的，外切核酸酶III识别双链DNA作为底物，如例如靶/引物或靶/引物延伸产物杂交物。消化借助于切割在3'末端脱氧核苷酸残基的5'末端上的磷酸二酯键而发生。因为这种类型的外切核酸酶在环境温度下有活性，所以所有非特异性退火的引物和引物延伸产物因此被消化。在一些实施方案中，这导致扩增反应甚至增强的特异性。然而，依赖于预温育时间的持续时间的非特异性引物消化可以导致引物浓度中相当大和不受控制的减少，这依次可以影响扩增反应自身。f)经修饰的引物单独或与外切核酸酶组合使用EP0799888和GB2293238公开了给PCR反应添加:V封闭的寡核苷酸。由于:V封闭，这些寡核苷酸不能充当引物。封闭的寡核苷酸设计为与PCR引物竞争/相互作用，这导致非特异性产物的减少。另一个替代方案是硫代磷酸酯寡核苷酸引物与外切核酸酶III组合在PCR反应混合物中的使用(EP0744470)。在这种情况下，通常接受双链以及单链DNA底物的3'外切核酸酶降解双链体人为产物例如引物二聚体以及遗留(carry over)扩增子，同时使单链扩增引物不降解。类似地，已提议使用具有基 本修饰的3'末端和经由大肠杆菌内切核酸酶IV的模板依赖性去除的引物(US5，792，607)。一般想法的具体实施方案在EP1275735中找到。它的说明书公开了用于执行核酸扩增反应的组合物，其包含(i)耐热的DNA聚合酶，(ii)耐热的3' -5'外切核酸酶，和(iii)具有经修饰的3'末端残基的用于核酸扩增的至少一种引物，这经由所述耐热的DNA聚合酶不延伸，以及使用这种组合物用于执行PCR反应的方法。此外，该方法涉及包含此种组合物的试剂盒。然而，公开的替代方案的主要缺点是，对于每种PCR反应需要经修饰的引物，这导致关于增加每次个别测定的成本增加的要求。g)其他PCR添加剂本领域已知的其他有机添加剂如DMS0、甜菜碱和甲酰胺(W099/46400 ；Hengen,P.N., Trends Biochem Sci22(1997)225-6 ；Chakrabarti, R.和 Schutt, C.E., NucleicAcid本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽，其选自H?DIET?NH2H?DIETDIET?NH2H?DIETDIETDIET?NH2和H?FDGDFDGD?NH2。

【技术特征摘要】
2006.02.27 EP 06003903.91.具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽，其选自 H-DIET-NH2H-DIETDIET-NH2H-DIETDIETDIET-NH2和 H-FD⑶FD⑶-NH2。2.组合物，其包含 -耐热的DNA聚合酶 -至少一类二价阳离子，优选地Mg2+ -脱氧核苷酸 -缓冲液 -具有不超过30的长度的合成肽。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：W安肯鲍尔，D海因德尔，F劳，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：