本发明专利技术公开了一种利用电化学发光法检测治疗性抗体类药物的细胞结合活性的方法，包括：1）将细胞铺于96孔板中，孵育；2）加入封闭液，孵育，进行封闭；3）缓冲液清洗后，加入治疗性抗体类药物，孵育；4）缓冲液清洗后，加入钌标记的抗人IgG，孵育；5）缓冲液清洗后，加入无表面活性剂的MSD read缓冲液；6）用MSD Sector Imager6000读96孔板，得到细胞结合活性结果。本发明专利技术大大提高了实验的精确度与灵敏度，大大缩短了时间，解决流式细胞仪检测细胞表面高表达受体所存在的仪器缺陷。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测治疗性抗体类药物的细胞结合活性的方法，特别是涉及一种 。
技术介绍
现阶段，国内生物制药行业在检测大分子抗体药物与其受体的结合活性时，主要 是通过酶联免疫吸附巧LISA)的方法。ELISA作为常规的结合活性方法，在检测大分子抗 体药物与其受体的结合活性时存在一些难W克服的问题：1)一些抗原表位（如受体）难W 获得商业化的产品，或受体提取制备比较困难；2)在做细胞结合试验（cell-basedbinding assay)时，细胞无法包被在板上，尤其是息浮细胞；3)实验过程中需要反复的清洗，多步 骤，比较繁琐耗时。目前，另一种细胞结合试验是通过流式细胞仪来检测，虽然用流式细胞 仪检测不用多次清洗，但却存在仪器本身的技术平台问题：当一些受体在细胞表面表达很 高时，会超出仪器的检测限，在做活性试验时会检测不到上平台，从而无法定量；同时在每 次使用流式细胞仪前都需要校正，比较费时。 电化学发光（E化）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。包括 了两个过程，电化学反应过程；在工作电极上（阳极）加一定的电压能量作用下，二价的H氯 联化巧钉"释放电子发生氧化反应而成为H价的H氯联化巧钉3+，同 时电极表面的H丙胺自由基（TPA)也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA+，并 迅速自发脱去一个质子而形成H丙胺自由基（TPA)，该样在反应体系中就存在具有强氧化 性的H价的H氯联化巧钉3+和具有强还原性的H丙胺自由基（TPA)。化学发光 过程；具有强氧化性的H价的H氯联化巧钉3+还原成激发态的二价 的H氯联化巧钉"W英光机制衰变并W释放出一个波长为 620nm光子的方式释放能量，而成为基态的2+和H丙胺自由基（TPA)，使得电极表面的电化 学反应和化学发光过程可W继续进行，该样整个反应过程可W循环进行。通过上诉的循环 过程，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大大的提高。 电化学发光免疫法是新一代的标记免疫测定技术，既兼有发光分析的高灵敏度和 抗原抗体反应的高度特异性，因此，具有广泛的应用价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种利用电化学发光法（E化）检测治疗性抗体类 药物的细胞结合活性的方法。该方法是针对现有化ISA和流式细胞仪测定细胞结合试验的 缺点进行开发的，而且本专利技术的方法能解决流式细胞仪检测细胞表面高表达受体所存在的 仪器缺陷，同时实现了用细胞铺板能更直接的反应其生物学活性，为cell-basedbinding assay提供一种更灵敏、简洁有效的方法。 为解决上述技术问题，本专利技术的利用电化学发光法检测治疗性抗体类药物的细胞 结合活性的方法，包括步骤： 1)将细胞铺于96孔板中，赔育1~化；[000引 2)加入封闭液，赔育30min~Ih进行封闭；[000引其中，封闭液是含体积浓度为10%~30%FBS(胎牛血清）的缓冲液； 3)缓冲液清洗后，加入治疗性抗体类药物，赔育1~化； 4)缓冲液清洗后，加入钉标记的抗人IgG(GoatAntiHumanAntibody,SULF0-TAG L油eled),赔育1~1.化； 5)缓冲液清洗后，加入无表面活性剂的MSDread缓冲液； 6)用MSDSectorImager6000读96孔板，得到细胞结合活性结果。 所述步骤1)中，细胞包括；表达相关表位的细胞，如包括；Raji、WIL2-S或DS-1等 细胞【该些B细胞可表达MHCII分子，MHC(majorhistocompatibilitycomplex);主要组 织相容性复合体】等；96孔板包括；MSD(MesoScaleDiscoveiy,Gaithersburg,MD)公司 的Single-SP0T96孔板；96孔板中的细胞密度为2XlO3个/孔~2XlO6个/孔，96孔板中 的细胞息液为25yL/孔~50yL/孔。[001引所述步骤2)中，封闭液优选含体积浓度为10%~30%FBS的1XPBS缓冲液（即磯 酸盐缓冲液）；封闭液的用量为40yL/孔~60yL/孔。 所述步骤3)、4)和5)中，缓冲液清洗中的缓冲液包括；1XPBS缓冲液；缓冲液的 抑优选为7. 1~7. 3 (优选抑7. 2);清洗的次数优选为3次。 所述步骤3)中，治疗性抗体类药物包括；单克隆抗体药物；其中，单克隆抗体的大 小为140~160邸巧日大约150邸）;治疗性抗体类药物的加入量为40yL/孔~60yL/孔， 加入浓度范围为20yg治疗性抗体/mL~0. 05ng治疗性抗体/mL。 所述步骤4)中，钉标记的抗人IgG是MSD公司的钉标记的抗人IgG，其用量为 40y L/孔~60y L/孔。 所述步骤5)中，无表面活性剂的MSDread缓冲液是MSD公司的产品，其用量为 150yL/ 孔~200yL/ 孔。 所述步骤6)中，细胞结合活性的评价标准是W相对活性进行评价，其中，相对活性 的计算公式如下： 其中，测得的活力是指MSDSectorImager6000所测量得到的结果，预期的活力是 通过常规的紫外分光光度法检测UV280nm所测得的抗体浓度，并且相对活性为70%~130% 则说明治疗性抗体类药物的生物学效力符合可接受标准。 本专利技术中，活性炭将细胞紧紧吸附在96孔板上，通过电化学发光法，使钉标记的 抗人IgG与目标测定物巧日单抗药物）特异性结合能检测目标测定物巧日单抗药物）与细胞 表面受体结合的结合活性。钉的化学性质不活泼，在空气和潮湿环境中稳定；有形成配位化 合物的强烈倾向。将二价的H氯联化巧钉"与免疫体系中的一种物质结合，检 测反应体系中的二价的H氯联化巧钉"经电化学发光过程后所发出的光，电化 学发光过程产生的光信号的强度与二价的H氯联化巧钉"成线性关系。 本专利技术的有益效果如下：OH氯联化巧钉为水溶性，且高度稳定的小分子物质，保证电当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用电化学发光法检测治疗性抗体类药物的细胞结合活性的方法，其特征在于，包括步骤：1）将细胞铺于96孔板中，孵育1～2h；2）加入封闭液，孵育30min～1h进行封闭；其中，封闭液是含体积浓度为10%～30%胎牛血清的缓冲液；3）缓冲液清洗后，加入治疗性抗体类药物，孵育1～2h；4）缓冲液清洗后，加入钌标记的抗人IgG，孵育1～1.5h；5）缓冲液清洗后，加入无表面活性剂的MSD read缓冲液；6）用MSD Sector Imager6000读96孔板，得到细胞结合活性结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，李丽丽，吉静娴，阙红，周伟昌，陈智胜，贾晓青，
申请(专利权)人：上海药明康德新药开发有限公司，无锡药明康德生物技术股份有限公司，百奇生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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