本发明专利技术涉及电化学免疫传感器技术领域，特别是涉及一种基于纳米探针C60的癌胚抗原的电化学免疫传感器的构建方法。具体是先采用循环伏安法在玻碳电极表面修饰上金纳米簇作为抗体捕获基底，然后将第一抗体与抗原依次固载在电极表面，最后通过抗原与抗体之间的特异性结合来固定AuNPs@L-cys-C60标记的第二抗体。金纳米簇具有良好的生物相容性，优异的导电性和大的表面积，能够促进蛋白质和电极之间的电子传递。以AuNPs@L-cys-C60为氧化还原纳米探针，基于抗原抗体之间良好的特异性，该传感器用于检测癌胚抗原，根据对不同浓度的癌胚抗原的电化学信号的不同，实现对癌胚抗原的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及电化学免疫传感
，特别是涉及一种基于纳米探针C60的癌胚抗原(CEA)的电化学免疫传感器的构建方法。具体涉及一种金纳米簇作为抗体捕获基底，AuNPsL-cys-C60标记的第二抗体作为氧化还原探针的电化学免疫传感器的构建方法。
技术介绍
CEA属于胚胎抗原中的一种，是一种正常成分，因其在胚胎发育阶段由胚胎组织产生。随着胚胎的生长，胚胎的后期胚胎抗原的含量减少，出生后会逐渐消失或仅存在极微量。当细胞癌变时，此类抗原可被重新合成，并且表达于肿瘤细胞表面，也可分泌到血液中，其含量与细胞恶性程度常常呈正相关，因此，临床诊断上常把CEA作为检测肿瘤的一个重要指标。目前测定CEA的免疫方法主要有酶联免疫分析，荧光免疫分析，放射免疫分析等。这些传统的免疫分析方法通常存在操作复杂，价格昂贵，不适合实时检测。电化学免疫传感器由于所需仪器设备简单，灵敏度高，检测速度快，成本低，尤其是满足实时检测的需要而备受人们的广泛关注。基于电化学传感器的优良性质本专利技术制备了一种基于纳米探针C60的CEA的电化学免疫传感器，以C60为电化学探针，通过抗原抗体之间高度的特异性结合实现对CEA的检测。本专利技术中金纳米簇作为第一抗体捕获基底，由于其良好的生物相容性，优异的导电性和大的表面积，不仅可以负载更多的抗体，而且可以促进蛋白质和电极之间的电子传递。AuNPsL-cys-C60作为电化学检测时的氧化还原纳米探针用于第二抗体的标记，基于抗原抗体之间良好的特异性，该传感器用于检测CEA。在本专利技术中构建的电化学免疫传感器具有成本低，稳定性好，制备过程简单，灵敏度高等优点，有效克服了目前CEA检测方法的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是以AuNPsL-cys-C60为电化学氧化还原探针，构建了一种简单快速，稳定性好，灵敏度高的电化学免疫传感器。本专利技术的目的之二是将该电化学免疫传感器用于CEA的检测。本专利技术的技术方案为：1.一种基于纳米探针C60的CEA的电化学免疫传感器的构建方法：(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；(2)取10μL1~2.5μg/mL的CEA第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab1/nano-Au/GCE；(3)取10μL质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到Ab1/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1/nano-Au/GCE；(4)将10μL0.1pg/mL~1.0ng/mL的一系列不同浓度的CEA标准溶液滴涂到BSA/Ab1/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到CEA/BSA/Ab1/nano-Au/GCE；(5)滴加6~10μLAuNPsL-cys-C60标记CEA第二抗体(Ab2-AuNPsL-cys-C60)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL10.0mmoL的四辛基溴化铵甲苯溶液滴涂到电极表面室温下孵育10min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于纳米探针C60的CEA的电化学免疫传感器(Ab2-AuNPsL-cys-C60/CEA/BSA/Ab1/nano-Au/GCE)。2.上述的Ab2-AuNPsL-cys-C60的制备：(1)AuNPsL-cys-C60的制备在磁力搅拌下，将0.40g的L-cys加入到于1mL7.1moL/L的NaOH溶液中，然后加入8mL乙醇继续搅拌使得溶液充分混匀，将2mL1mg/mL的C60的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室温下持续搅拌24h，用超纯水离心洗涤3次得到L-cys-C60；将L-cys-C60重新分散到4mL超纯水中，取2mL0.01mol/L的HAuCl4加入到上述溶液中搅拌24h，之后滴加0.03mol/L的抗坏血酸直至溶液成黑色，用超纯水离心洗涤得到AuNPsL-cys-C60，将AuNPsL-cys-C60重新分散到2mL超纯水中；(2)Ab2-AuNPsL-cys-C60的制备取0.2mL10μg/mL的Ab2在搅拌的条件下加入到2mLAuNPsL-cys-C60溶液中，室温下搅拌30min后在4℃下孵育过夜，得到的混合溶液在9000r/s离心15min，弃去上清液，重新溶解到1mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到Ab2-AuNPsL-cys-C60溶液。3.CEA的检测：(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。在PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液及未特异性结合CEA的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.4V~0.4V，扫描速度为100mV/s，记录示差脉冲伏安图，根据所得的峰电流值和CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；(3)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。本专利技术的有益成果(1)本专利技术以金纳米簇作为第一抗体捕获基底，不仅可以负载更多的抗体，而且可以促进蛋白质和电极之间的电子传递，进而增加电极的灵敏度；另外AuNPsL-cys-C60作为电化学检测时的氧化还原纳米探针用于第二抗体的标记，一方面可以增加第二抗体的负载量，另一方面可以有效避免氧化还原探针分子的渗漏；(2)本专利技术制备的电化学免疫传感器用于CEA的检测，具有简单、快速、高灵敏检测的优势，线性范围为0.1pg/mL~1.0ng/mL，检出限为0.05pg/mL。附图说明：图1所示为不同浓度CEA的差分脉冲伏安图。图2所示为本专利技术峰电流差值与lgc线性关系图。其中，图1中由a到j的氧化峰图分别代表CEA的浓度为0、1.0×10-13、5.0×10-13、1.0×10-12、5.0×10-12、1.0×10-11、5.0×10-11、1.0×10-10、1.0×10-9g/mL；具体实施方式：为了更好地理解本专利技术，下面用具体实例来详细说明本专利技术的技术方案，但是本专利技术并不局限于此。实施例1一种基于纳米探针C60的CEA的电化学免疫传感器的构建方法<本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于纳米探针C60的癌胚抗原(CEA)的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于包括以下步骤： (1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；以10 mL含有浓度为1.0 mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在‑0.8～0.6 V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1 moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH 7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano‑Au/GCE)；(2)取10 μL 1~2.5 μg/mL的CEA第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano‑Au/GCE表面，在4 ℃冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab1/nano‑Au/GCE；(3)取10 μL 质量分数为1~3%的BSA溶液滴涂到Ab1/nano‑Au/GCE表面，在37 ℃下孵育1 h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1/nano‑Au/GCE；(4)将10 μL 0.1 pg/mL~1.0ng/mL的一系列不同浓度的CEA标准溶液滴涂到BSA/Ab1/nano‑Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到CEA/BSA/Ab1/nano‑Au/GCE；(5)滴加6~10 μL AuNPs@L‑cys‑C60标记CEA第二抗体(Ab2‑AuNPs@L‑cys‑C60)到上述电极表面，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10 μL 10 mmoL的四辛基溴化铵甲苯溶液滴涂到电极表面室温下孵育10min后用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于纳米探针C60的CEA的电化学免疫传感器(Ab2‑AuNPs@L‑cys‑C60/CEA/BSA/Ab1/nano‑Au/GCE)。...
【技术特征摘要】
1.一种基于纳米探针C60的癌胚抗原(CEA)的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10μL1~2.5μg/mL的CEA第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab1/nano-Au/GCE；
(3)取10μL质量分数为1~3%的BSA溶液滴涂到Ab1/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(4)将10μL0.1pg/mL~1.0ng/mL的一系列不同浓度的CEA标准溶液滴涂到BSA/Ab1/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到CEA/BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(5)滴加6~10μLAuNPsL-cys-C60标记CEA第二抗体(Ab2-AuNPsL-cys-C60)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL10mmoL的四辛基溴化铵甲苯溶液滴涂到电极表面室温下孵育10min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于纳米探针C60的CEA的电化学免疫传感器(Ab2-AuNPsL-cys-C60/CEA/BSA/Ab1/nano-Au/G...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑香丽，周长利，夏方诠，田栋，花小霞，乔雪莹，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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