一种高通量的电化学发光检测方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量的电化学发光检测方法，通过可导电的盘式多孔微孔盘进行电化学发光反应，接着将完成电化学发光反应的微孔盘送到图像采集系统后，利用电荷耦合器或是互补金属氧化物半导体作为图像传感器，在无光源的情况下，采集发光样本图像；经数据分析系统通过微孔盘图像对比，自动判断微孔盘类型；将图像数字化后转换为灰度值，判断出发光点，对发光点自动套圈，以确定点位置；通过对反应后的微孔盘连续拍摄、合成计算灰度平均值，最后依据线性关系，将灰度值换算成浓度，实现定性或是定量结果分析；本发明专利技术能同时检测多个样本，具有高通量优势；每个微孔能容纳多个蛋白指标，实现多指标检测；能进行数字化的大量判读，检测速度快。

High throughput electrochemical luminescence detection method

The invention discloses a high-throughput electrochemical luminescence detection method, electrochemical luminescence reaction through the porous conductive microplate disc, then complete the microplate electrochemiluminescence reaction to the image acquisition system, using CCD or complementary metal oxide semiconductor as the image sensor, the light source under the condition of the sample image acquisition light; by the data analysis system through the micro disk image contrast, automatically determine the microplate type; the image is transformed into digital gray value judgment based on the luminescent spot, automatic ring, to determine the location of the microplate; through the reaction after continuous shooting, calculated the mean gray value, according to the linear the relationship between the gray value, converted into concentration, realize the qualitative or quantitative analysis of the results; the invention can detect a plurality of samples at the same time It has the advantage of high flux; each micro hole can hold more than one protein index, and can realize multi index detection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物传感器领域，具体是一种高通量的电化学发光检测方法。
技术介绍
电化学发光免疫测定(Electrochemiluminescence immunoassay, ECLI)是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，电化学发光法源于电化学法和化学发光法，而ECLI 是电化学发光和免疫测定相结合的技术，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光二个过程，电化学发光反应原理是在工作电极上阳极加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌 [Rubpy3]2+释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3]3+，同时，电极表面的 TPA 也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基 TPA+，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基 TPA，这样，在反应体系就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3]3+ 和具有强还原性的三丙胺自由基TPA；这时具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 3+和具有强还原性的三丙胺自由基TPA发生氧化还原反应，结果使三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3]3+还原成激发态的二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 2+，其能量来源于三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 3+ 与三丙胺自由基TPA之间的电势差，激发态[Rubpy3] 2+以荧光机制衰变并以释放出一个波长为 620nm 光子的方式释放能量，而成为基态的[Rubpy3] 2+；上述化学发光过程后，反应体系中仍存在二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 2+和三丙胺TPA，使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以循环进行，通过上述的循环过程，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大大提高，所以ECL测定具有高灵敏的特点，上述电化学发光过程产生的光信号的强度与二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 2+的浓度成线性关系，将二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 2+与免疫反应体系中的一种物质结合，经免疫反应后，检测免疫反应体系中剩余二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 2+经所发出的光，即可得知待检物的浓度；罗氏Elecsys及Cobase系列是目前最普及的电化学发光系统，标记Ruthenium的高特异性抗体与被测物结合后与顺磁性微珠结合，利用磁场吸附磁性微珠后，施加电压启动电化学发光反应，最后用光电倍增管检测发射光信号，发射光信号与被测物浓度成线性关系，但是目前的电化学发光法，一次只能检测一个样本，即一种蛋白含量，无法高通量的进行多种蛋白含量的检测，需要对现有技术进行改进，以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过微孔板及图像采集与数据分析系统实现高通量的电化学发光检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高通量的电化学发光检测方法，采用一个用于化学分析的微孔盘和一个图像采集与数据分析系统实现检测，所述微孔盘由基片板及网状格子架上下组合而成，基片板的长度为16cm、宽度为9cm、厚度为0.5cm，基片板上表面利用磁控溅射的方法镀有一层氧化铟锡膜，氧化铟锡膜的设置使得基片板具有导电功能，从而作为一个电极使用，镀有氧化铟锡膜的基片板表面还附着有导电性能优良且具有蛋白质分子吸附功能的石墨烯膜修饰层；所述网状格子架的长度为16cm、宽度为9cm、厚度为1cm，网状格子架与基片板均采用聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙烯或聚乙烯等塑胶材质制成；网状格子架与基片板组成微孔盘后，使得微孔盘上的每个微孔均能测定一个样本，且每个微孔之间互不干扰，实现多个样本同时测定；所述检测方法包括以下步骤：1）微孔盘电化学发光反应：进行电化学发光分析测定时，接上标记有电化学发光物的物质，对基片板进行通电，电化学发光物就会发生电化学发光反应；2）接着将完成电化学发光反应的微孔盘送到图像采集系统后采集、浏览样本图像，利用电荷耦合器（Charge Coupled Device,CCD）或是互补金属氧化物半导体（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor, CMOS)作为图像传感器，在无光源的情况下，采集电化学发光反应后的发光样本图像，采集的样本图像通过数据分析系统进行定性或定量的分析与判读，首先通过微孔盘图像对比，自动判断微孔盘类型；数据分析系统具有自动套圈功能，将图像数字化后转换为灰度值，判断出发光点，对发光点自动套圈，通过灰度值差异，划定图像有效区域、网格划分、校正点间距、阵间距等，以确定点位置，通过对反应后的微孔盘连续拍摄、合成、计算，获取灰度平均值，最后依据线性关系，将灰度值换算成浓度，用以定性或是定量结果分析。作为本专利技术进一步的方案：所述石墨烯膜修饰层是通过化学还原反应将氧化石墨烯还原成石墨烯制成，所述石墨烯膜修饰层制作步骤包括：1）在清洗过的基片板表面滴加5～15 微升浓度为0.1～0.4ｇ/L的氧化石墨烯溶液，常温下自然干燥；２）在步骤1中处理得到的基片板表面滴加5～15 微升水、肼和氨水体积比为100 ：（0.4～1 ）：（0.8～4 ）的肼溶液，或1×10-3～1×10-2 mol/L的溴化氢溶液作为还原剂，在25～30℃下放置12～24 小时直至干燥；3）用水清洗步骤2处理得到的基片板，得到具有石墨烯膜修饰层的基片板。作为本专利技术再进一步的方案：所述网状格子架的规格包括但不限于：96个方格，方格面积8mm*8mm，每个方格容纳4个蛋白指标检测；24个方格，方格棉结为1.6cm*1.6cm，每个方格容纳16个蛋白指标检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术相较于管式检测法，通过采用盘式电化学检测的方式，最多可以实现一次性同时检测96个样本，具有高通量优势；通过在微孔盘的基片板上镀设氧化铟锡膜和石墨烯膜修饰层，使得本专利技术的微孔盘具有导电性，使其能够直接用于电化学发光反应，兼具导电剂吸附蛋白质的特性；每个微孔能够容纳4个或16个蛋白指标，实现多指标检测，大大提升了灵敏度和特异性，提供更多种疾病检测意义；以CCD或COMS截取图像，实现一次性进行数字化的大量判读，远快于光电倍管单次放大判读，检测快速。附图说明图1为本专利技术中基片板部分的结构示意图。图2为本专利技术中规格为8mm*8mm的网状格子架的结构示意图。图3为本专利技术中规格为 1.6cm*1.6cm的网状格子架的的结构示意图。图4为本专利技术的工作流程示意框图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1～4，本专利技术实施例中，一种高通量的电化学发光检测方法，采用一个用于化学分析的微孔盘和一个图像采集与数据分析系统实现检测，所述微孔盘由基片板1及网状格子架4上下组合而成，基片板1的长度为16cm、宽度为9cm、厚度为0.5cm，基片板1上表面利用磁控溅射的方法镀有一层氧化铟锡膜2，氧化铟锡膜2的设置使得基片板1具有导电功能，从而作为一个电极使用，镀有氧化铟锡膜2的基片板1表面还附着有导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量的电化学发光检测方法，采用一个用于电化学发光分析的微孔盘和一个图像采集与数据分析系统实现检测，其特征在于：所述微孔盘由基片板（1）及网状格子架（4）上下组合而成，基片板（1）的长度为16cm、宽度为9cm、厚度为0.5cm，基片板（1）上表面利用磁控溅射的方法镀有一层氧化铟锡膜（2），氧化铟锡膜（2）的设置使得基片板（1）具有导电功能，从而作为一个电极使用，镀有氧化铟锡膜（2）的基片板（1）表面还附着有导电性能优良且具有蛋白质分子吸附功能的石墨烯膜修饰层（3）；所述网状格子架（4）的长度为16cm、宽度为9cm、厚度为1cm，网状格子架（4）与基片板（1）均采用聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙烯或聚乙烯等塑胶材质制成；网状格子架（4）与基片板（1）组成微孔盘后，使得微孔盘上的每个微孔（5）均能测定一个样本，且每个微孔（5）之间互不干扰，实现多个样本同时测定；所述检测方法包括以下步骤：1）微孔盘电化学发光反应：进行电化学发光分析测定时，接上标记有电化学发光物的物质，对基片板进行通电，电化学发光物就会发生电化学发光反应；2）接着将完成电化学发光反应的微孔盘送到图像采集系统后采集、浏览样本图像，利用电荷耦合器（Charge Coupled Device,CCD）或是互补金属氧化物半导体（Complementary Metal‑Oxide‑Semiconductor, CMOS)作为图像传感器，在无光源的情况下，采集电化学发光反应后的发光样本图像，采集的样本图像通过数据分析系统进行定性或定量的分析与判读，首先通过微孔盘图像对比，自动判断微孔盘类型；数据分析系统具有自动套圈功能，将图像数字化后转换为灰度值，判断出发光点，对发光点自动套圈，通过灰度值差异，划定图像有效区域、网格划分、校正点间距、阵间距等，以确定点位置，通过对反应后的微孔盘连续拍摄、合成、计算，获取灰度平均值，最后依据线性关系，将灰度值换算成浓度，用以定性或是定量结果分析。...

【技术特征摘要】
1.一种高通量的电化学发光检测方法，采用一个用于电化学发光分析的微孔盘和一个图像采集与数据分析系统实现检测，其特征在于：所述微孔盘由基片板（1）及网状格子架（4）上下组合而成，基片板（1）的长度为16cm、宽度为9cm、厚度为0.5cm，基片板（1）上表面利用磁控溅射的方法镀有一层氧化铟锡膜（2），氧化铟锡膜（2）的设置使得基片板（1）具有导电功能，从而作为一个电极使用，镀有氧化铟锡膜（2）的基片板（1）表面还附着有导电性能优良且具有蛋白质分子吸附功能的石墨烯膜修饰层（3）；所述网状格子架（4）的长度为16cm、宽度为9cm、厚度为1cm，网状格子架（4）与基片板（1）均采用聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙烯或聚乙烯等塑胶材质制成；网状格子架（4）与基片板（1）组成微孔盘后，使得微孔盘上的每个微孔（5）均能测定一个样本，且每个微孔（5）之间互不干扰，实现多个样本同时测定；所述检测方法包括以下步骤：1）微孔盘电化学发光反应：进行电化学发光分析测定时，接上标记有电化学发光物的物质，对基片板进行通电，电化学发光物就会发生电化学发光反应；2）接着将完成电化学发光反应的微孔盘送到图像采集系统后采集、浏览样本图像，利用电荷耦合器（Charge Coupled Device,CCD）或是互补金属氧化物半导体（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor, CMOS)作为图像传感器，在无光源的情况下，采集电化学发光反应后的发...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱一帆，
申请(专利权)人：德必碁生物科技厦门有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35