本发明专利技术涉及一种基于Silica/chitosan/Ru纳米粒子电化学发光法检测汞离子的方法，其是由步骤(1)合成掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子、(2)空白Silica/chitosan/Ru-ssDNA体系的制备、(3)Silica/chitosan/Ru-DNA/Hg体系的制备、(4)修饰电极的组装、(5)电化学发光信号检测、(6)ΔIi-CHgi标准曲线以及(7)检测组成，其无需复杂的探针分子标记和固定过程，省时、成本低并且不影响富含T碱基的DNA对汞离子的识别，同时将化学修饰电极、纳米粒子富集技术和电化学发光分析技术结合起来，实现了高灵敏度检测Hg2+，检出限达3pM。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米检测
，具体涉及一种以掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化 娃复合纳米粒子（Silica/Ru(bpy)32+/Chitosan nanoparticles，简称：Silica/chitosan/ Ru)为电化学发光指示剂和以富含T碱基的DNA为探针分子的检测汞离子的方法。
技术介绍
作为生态系统中高毒性的重金属污染物之一，汞离子能引起严重的环境和人类健 康问题，据报道，汞离子能特异性地与DNA (富含T碱基）中的两个T碱基作用形成稳定的 T - Hg2+ - T络合物，这促进了许多基于T - Hg2+ - T配位化学原理设计的荧光、比色、电化学 和电化学发光传感检测汞离子的方法的发展。但这些方法需要复杂的探针分子标记和固定 过程，这不仅耗时和成本高、而且影响富含T碱基的DNA对汞离子的识别特性。因此，发展 一种无标记、无固定化的检测汞离子的电化学发光方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于Silica/chitosan/Ru纳米粒子电化学发光法检测 汞离子的方法，其实现了无标记、无固定化的检测，而且速度快、灵敏度高。 为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是由以下步骤组成： (1)掺杂壳聚糖和联啦啶舒的二氧化娃复合纳米粒子的合成 在室温下，将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1:1:4. 0~1:1:4. 3混合均 勾，搅拌下加入200~300 yL超纯水，搅拌20~30min后，依次加入0. 1% (w/v)的壳聚糖 和0· 01mol/L联P比啶^!了，并加入0· lmol/L NaOH调节体系至中性，继续搅拌40~60min，依 次将正硅酸乙酯与氨水按体积比为1 :〇. 6~1:0. 8的量加入，使正硅酸乙酯与壳聚糖、联吡 啶钌以及正己醇的体积比为I : 1:0. 5:15~1:1. 3:0. 8:25,持续搅拌20~24h，待反应完成 后，加入丙酮破乳，离心收集，分别用无水乙醇和超纯水洗涤，获得的Silica/chitosan/Ru 溶液，将其分散在超纯水中于2~8°C保存； (2)空白 Silica/chitosan/Ru-ssDNA 体系的制备 将浓度为lOnmol/L富含T碱基的ssDNA退火处理后与步骤（1)所制得的Silica/ chitosan/Ru溶液按照体积比1:1~1:4的量混合，加 PBS缓冲液定容至200 μ L，反应30~ 40min，得到 Silica/chitosan/Ru-ssDNA 体系； (3) Silica/chitosan/Ru-DNA/Hg 体系的制备 将浓度为lOnmol/L富含T碱基的ssDNA退火处理后与不同浓度梯度的Hg2+标准 液混合，反应10~35min后，向各个混合液中加入步骤（1)所制得的Silica/chitosan/Ru 溶液，使富含T碱基的ssDNA与Silica/chitosan/Ru溶液的体积比为1:1~1:4,加 PBS缓 冲液定容至200 μ L，反应30~40min，得到一系列不同Hg2+浓度对应的Silica/chitosan/ Ru-DNA/Hg 体系； (4)修饰电极的组装 将 Nafion/CNT 修饰电极先后浸入到步骤（2)的 Silica/chitosan/Ru - ssDNA 体 系中和步骤（3)的 Silica/chitosan/Ru-DNA/Hg 体系中，反应 40 ~50min，完成 Silica/ chitosan/Ru - ssDNA 和系列 Silica/chitosan/Ru-DNA/Hg 体系在修饰电极上的组装； (5)电化学发光检测 将步骤（4)得到的修饰电极分别用超纯水充分冲洗、吹干后，按照常规方法进行 电化学发光检测，分别得到 Silica/chitosan/Ru-ssDNA 和系列 Silica/chitosan/Ru-DNA/ Hg组装到Nafion/CNT修饰电极上所对应的电化学发光强度I。和I p i为1~η之间的正 整数，η为不同浓度梯度的Hg2+标准液的个数； (6) Δ Ii-Chs^准曲线 利用公式Δ Ii= I厂1。计算相应Hg2+浓度下的Silica/chitosan/Ru-DNA/Hg体系 与空白Silica/chitosan/Ru-ssDNA体系之间对应的电化学发光强度差值AIi，根据不同 Hg2+浓度C Hgl与所对应的Δ I i，绘制Δ Ii-Chs1标准曲线； (7)检测 按照（3)~（6)的操作步骤，用电化学发光检测方法检测出待测汞离子溶液与 Silica/chitosan/Ru-ssDNA体系的电化学发光强度差值Δ IiM，将所得的Δ 1#代入步骤 (6)的AI「CHgl标准曲线中，从而得到待测汞离子的浓度。 上述的ssDNA的T碱基个数不小于10, T碱基个数越多，与汞离子的作用越明显， 使检测灵敏度越高。 上述 ssDNA 的序列可以选择 5' -GTT GTT CTT CCT TTG TTT CCC CTT TCT TTG GTT GTT CTT C-3'或者也可以是 5' -CTT CTT TCT TCC CCT TGT TTG TTG-3'或者还可 以是 5，-TAC AGT TTC ACC TTT TCC CCC GTT TTG GTG TTT-3，。 上述步骤（1)所得的Silica/chitosan/Ru的粒径为59±3nm，粒径越均一，检测的 结果越可靠。 本专利技术所提供的用电化学发光法检测汞离子的方法是以掺杂壳聚糖和联吡啶钌 的二氧化娃复合纳米粒子（Silica/chitosan/Ru)为电化学发光指示剂，并以富含T碱基的 DNA为探针分子，基于该纳米粒子与探针分子和探针分子与汞离子复合物的结合能力不同， 并导致纳米粒子在修饰电极表面富集量不同，电化学发光信号的差别检测汞离子。与现有 技术相比，本专利技术具有如下特点： (1)本专利技术无需复杂的探针分子标记和固定过程，省时、成本低并且不影响富含T 碱基的DNA对萊尚子的识别； (2)将化学修饰电极、纳米粒子富集技术和电化学发光分析技术结合起来，实现了 高灵敏度检测Hg2+，检出限达3pM。【附图说明】 图1为所合成的掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子的透射电子显 微镜图。 图2为ssDNA与Hg2+作用的紫外-可见吸收光谱。【具体实施方式】 现结合实施例和附图对本专利技术的技术方案进行进一步说明，本专利技术不仅限下述的 实施情形。 实施例1 本实施例可通过电化学发光检测的方法，检测出水溶液样品中含有的重金属离子 Hg2+，具体由以下步骤实现： (1)掺杂壳聚糖和联吡啶1 了的二氧化娃复合纳米粒子（简称：Silica/chitosan/ Ru)的合成 在室温下，将I. 8mL的Triton X-100、l. 8mL正己醇和7. 5mL环己烷混合均匀，搅拌 下加入260 μ L超纯水，搅拌30min后，依次加入100 μ L 0.1% (w/v)的壳聚糖（Chitosan) 和50 μ L浓度为0· Olmol/L联吡啶钌（Ru (bpy) 32+，分子式C30H24Cl具Rir 6H20,分子量为 748. 62)，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于Silica/chitosan/Ru纳米粒子电化学发光法检测汞离子的方法，其特征在于由以下步骤组成：(1)合成掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子在室温下，将Triton X‑100、正己醇和环己烷按体积比1:1:4.0～1:1:4.3混合均匀，搅拌下加入200～300μL超纯水，搅拌20～30min后，依次加入0.1％(w/v)的壳聚糖和0.01mol/L联吡啶钌，并加入0.1mol/L NaOH调节体系至中性，继续搅拌40～60min，依次将正硅酸乙酯与氨水按体积比为1：0.6～1:0.8的量加入，使正硅酸乙酯与壳聚糖、联吡啶钌以及正己醇的体积比为1：1:0.5:15～1:1.3:0.8:25，持续搅拌20～24h，待反应完成后，加入丙酮破乳，离心收集，分别用无水乙醇和超纯水洗涤，获得的Silica/chitosan/Ru溶液，将其分散在超纯水中于2～8℃保存；(2)空白Silica/chitosan/Ru‑ssDNA体系的制备将浓度为10nmol/L富含T碱基的ssDNA退火处理后与步骤(1)所制得的Silica/chitosan/Ru溶液按照体积比1:1～1:4的量混合，加PBS缓冲液定容至200μL，反应30～40min，得到空白Silica/chitosan/Ru‑ssDNA体系；(3)Silica/chitosan/Ru‑DNA/Hg体系的制备将浓度为10nmol/L富含T碱基的ssDNA退火处理后与不同浓度梯度的Hg2+标准液混合，反应10～35min后，向各个混合液中加入步骤(1)所制得的Silica/chitosan/Ru溶液，使富含T碱基的ssDNA与Silica/chitosan/Ru溶液的体积比为1:1～1:4，加PBS缓冲液定容至200μL，反应30～40min，得到一系列不同Hg2+浓度对应的Silica/chitosan/Ru‑DNA/Hg体系；(4)修饰电极的组装将Nafion/CNT修饰电极先后浸入到步骤(2)的Silica/chitosan/Ru–ssDNA体系中和步骤(3)的Silica/chitosan/Ru‑DNA/Hg体系中，反应40～50min，完成Silica/chitosan/Ru–ssDNA和系列Silica/chitosan/Ru‑DNA/Hg体系在修饰电极上的组装；(5)电化学发光信号检测将步骤(4)得到的修饰电极分别用超纯水充分冲洗、吹干后，按照常规方法进行电化学发光检测，分别得到Silica/chitosan/Ru‑ssDNA和系列Silica/chitosan/Ru‑DNA/Hg组装到Nafion/CNT修饰电极上所对应的电化学发光强度I0和Ii，i为1～n之间的正整数，n为不同浓度梯度的Hg2+标准液的个数；(6)ΔIi‑CHgi标准曲线利用公式ΔIi＝Ii‑Io计算相应Hg2+浓度下的Silica/chitosan/Ru‑DNA/Hg体系与空白Silica/chitosan/Ru‑ssDNA体系之间对应的电化学发光强度差值ΔIi，根据不同Hg2+浓度CHgi与所对应的ΔIi，绘制ΔIi‑CHgi标准曲线；(7)检测按照(3)～(6)的操作步骤，用电化学发光检测方法检测出待测汞离子溶液与Silica/chitosan/Ru‑ssDNA体系的电化学发光强度差值ΔI测，将所得的ΔI测代入步骤(6)的ΔIi‑CHgi标准曲线中，从而得到待测汞离子的浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑行望，蔡林芳，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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