一种铅-高密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种铅-高密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用，该铅-高密度脂蛋白螯合物是铅离子与高密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成，可用于制备检测人体铅-高密度脂蛋白螯合物的试剂。本发明专利技术首次证实了铅离子可直接作用于高密度脂蛋白。本发明专利技术建立了铅-高密度脂蛋白螯合物的定性定量检测方法，以检测一个地区人群体内高密度脂蛋白的含量，从而间接反映一个地区铅污染程度以及对人群的健康影响。本发明专利技术建立的铅-高密度脂蛋白螯合物定量检测方法准确度高重、复性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重金属离子的免疫学检测，具体涉及一种铅-高密度脂蛋白螯合物及 其制备方法和应用。
技术介绍
脂蛋白（lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复 合物，按密度分为高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL)、中间密度脂蛋白 (intermediate density lipoprotein，IDL)、低密度月旨蛋白(low density lipoprotein， LDL)、极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL)、乳糜颗粒。血液中大约 30%的胆固醇是通过HDL从组织细胞中运输到肝脏转化为胆汁酸或通过胆汁排出体外的。 动脉造影证明高密度脂蛋白胆固醇含量与动脉管腔狭窄程度呈显著的负相关，故被称为 "好胆固醇"，高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子，俗 称"血管清道夫"，其可以抑制癌细胞的转移扩散，对癌症的防控有重要作用。 但是，研宄表明高密度脂蛋白胆固醇的数量并不能与心血管疾病的保护程度成正 比，因为其中已经发生结构改变的高密度脂蛋白仍然可以测量到但已经丧失正常功能甚至 会加重动脉粥样硬化的进展。而高密度脂蛋白胆固醇的数量下降则可显著提示动脉粥样硬 化的保护性减弱，因而检测定量血清中HDL对于冠心病具有重要意义，不仅可以用于早期 识别动脉粥样硬化的危险性，而且可以作为脂类调节药物治疗过程的检测以及预后评价的 指标之一。 铅是一种常见的有毒金属及环境污染物，广泛应用于工业生产环境中，包括冶炼 锻造、铅电池生产、汽油添加剂的生产过滤中等，与人们生活息息相关。对于普通人群，主要 是通过吸入铅污染的空气，或饮用以铅壶或铅锡壶盛装的酒，甚至使用或滥用含铅的药物 治疗慢性疾病而摄入铅。研宄表明，铅是一种全身性毒物，可以影响神经、造血、内分泌、免 疫、生殖、肝脏、肾脏等组织器官，国际肿瘤研宄机构也将铅及其化合物列为第2B类人致癌 物。可见铅对机体的影响及其重要，不可忽视。 目前已有大量的文献证实铅可以作用于全身各个系统中的蛋白，从而影响机体各 组织器官的机能。众所周知，高密度脂蛋白是一种特殊意义的蛋白质，铅是否可以作用于高 密度脂蛋白，而使高密度脂蛋白结构改变、含量改变、活性改变、功能改变，这些尚缺乏相关 研宄。
技术实现思路
针对铅污染严重的问题，本专利技术的目的在于提供一种铅-高密度脂蛋白螯合物及 其制备方法，并建立铅-高密度脂蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铅-高 密度脂蛋白螯合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中 铅-高密度脂蛋白螯合物，可以间接反映这个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映这 个地区铅污染程度。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铅-高密度脂蛋白螯合 物，该铅-高密度脂蛋白螯合物是铅离子与高密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯 合而成。 本专利技术还提供一种上述的铅-高密度脂蛋白螯合物的制备方法，即体外合成法， 包括以下步骤： A)铅-高密度脂蛋白的合成：在提纯源于人体的高密度脂蛋白或按照生物学方法 重组的高密度脂蛋白中加入铅离子进行螯合反应，得到反应溶液； B)铅-高密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中 未反应的高密度脂蛋白、特异性抗体和铅离子，即得铅-高密度脂蛋白螯合物。 作为优选，所述步骤B)中具体包括以下步骤： (1)溶解样品：将上述步骤A)的提取的铅-高密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水 中，得铅-高密度脂蛋白螯合物溶液； (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与高密 度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱； 所述能与高密度脂蛋白特异性结合的填料为吸附有可与高密度脂蛋白特异性结 合物质的硅胶或树脂； (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)所述溶液，然后上柱，使高 密度脂蛋白与填料特异性结合； (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0· 05-0. lOmol/L的 Na2HPO^f液进行洗脱； (5)收集：收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原； (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本； (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铅特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱； 所述能与铅特异性结合的填料为吸附有可与铅特异性结合物质的硅胶或树脂； (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱； (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HPO^f液进行洗脱； (10)收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原； (11)透析：将步骤（10)的洗脱液装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C透 析过夜，收集样本，即得铅-高密度脂蛋白螯合物。 作为优选，上述铅-高密度脂蛋白螯合物的制备方法，还包括以下对铅-高密度脂 蛋白螯合物的鉴定步骤，具体包括以下步骤： (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床； (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铅-高密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中； (3)电泳：连接电泳板，进行电泳； (4)检测：在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铅以及检测铅的含量。 本专利技术还提供一种如上述的铅-高密度脂蛋白螯合物在制备检测人体内铅-高密 度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。 本专利技术还提供一种至少包括如上述的铅-高密度脂蛋白螯合物作为标准品的试 剂盒。 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获高密度脂蛋白的物质或捕 获金属铅的物质。 本专利技术还提供一种定量检测铅-高密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的铅-高密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、 酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铅-高 密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯铅-高密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合 法、提纯铅-高密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原 子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。 相比现有技术，本专利技术的有益效果在于： 1.本专利技术首次合成了铅-高密度脂蛋白螯合物； 2.本专利技术首次提出铅-高密度脂蛋白螯合物可用于制备检测血样中铅-高密度脂 蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用； 3.本专利技术实现了 -高密度脂蛋白螯合物的特异性识别和定量检测，以便定量检测 人群血清中铅-高密度脂蛋白螯合物的含量，以评价一个地区铅污染程度的应用，为工业 地区的铅污染水平提供间接指标。本专利技术建立的铅-高密度脂蛋白螯合物定量检测方法的 准确度高、重复性好。【附图说明】 图1为本专利技术所述的铅-高密度脂蛋白螯合物的非变性电泳条带图； 图2为本专利技术所述的铅-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铅‑高密度脂蛋白螯合物，其特征在于，该铅‑高密度脂蛋白螯合物是铅离子与高密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张积仁，阳帆，董欣敏，吴婧，蔡睿，孙遥，赵乙木，
申请(专利权)人：上海拜豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31