一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP及其制备方法和应用，抗植物病毒蛋白Rhp-PSP为具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；或将具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加形成的且具有抗植物病毒活性的氨基酸序列。其制备方法以光合细菌PSB06的总DNA为模板，进行PCR扩增。本发明专利技术提供的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP对植株无毒，稳定性高，抗病性强，可应用于植物病毒的防治。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种抗植物病毒基因Rhp-PSP及其制备方法和应用。
技术介绍
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是重要的农作物病害的病原物，具有高度的传染性和广泛的寄主范围，可侵染烟草、番茄、十字花科等38科350多种植物，危害经济农作物并造成巨大的经济损失，20世纪末统计世界每年仅由TMV造成的损失就超过1亿美元。近年来，由于化学防治经济作物病害会造成对人体的危害和重大的环境污染，人们倡导使用无公害产品防治农作物病害。蛋白农药是一种新型的生物农药，对人畜无害，环境友好，既能提高农产品附加值，又能增加经济收益，具有广阔的市场前景和良好的市场竞争力。我们发现可以抑制TMV活性的蛋白成分－高氯酸溶性蛋白(perchloric acid-soluble protein，PSP)，并命名为Rhp-PSP。高氯酸溶性酶PSP是一种核糖核酸内切酶，在无细胞翻译体系中能抑制蛋白合成，根据报道，PSP大多数都是在动物中被发现，而在微生物中鲜有被报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种植株无毒，稳定性高，抗病性强的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，还提供了该抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的制备方法和植物病毒防治中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的氨基酸序列为以下a和b中的一种：(a)具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；(b)将所述(a)的核苷酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加形成的且具有抗植物病毒活性的氨基酸序列。上述的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，优选的，所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的编码基因为以下(1)和(2)中的一种：(1)具有SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；(2)与所述(1)的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的核苷酸序列。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了上述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的制备方法，以光合细菌PSB06的总DNA为模板，进行PCR扩增，然后连接载体，获得重组子。上述的制备方法，优选的，具体包括以下步骤：S1、从PSB06菌液中提取PSB06总DNA；S2、以所述PSB06总DNA为模板进行PCR反应得到PCR产物；S3、将所述PCR产物与载体连接得到连接产物；S4、将所述连接产物置于感受态细胞中转化，获得重组子。上述的制备方法，优选的，还包括扩大培养步骤，具体为：S5、取包含所述重组子的菌液，进行质粒提取步骤得到质粒DNA；S6、将所述质粒DNA置于感受态细胞中转化、诱导表达，得到抗植物病毒蛋白Rhp-PSP。上述的制备方法，优选的，所述PCR扩增过程，以SEQ ID NO.3所述的DNA序列、SEQ ID NO.4所述的DNA序列为引物。上述的制备方法，优选的，所述步骤S3具体为将PCR产物与载体按照体积比为3～5∶1混合，于25℃下连接反应5～10min。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP或上述制备方法制备得到的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP在抗植物病毒中的应用。上述的应用，优选的，所述植物病毒为烟草花叶病毒。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术提供了一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，该植物病毒蛋白从光合细菌PSB06中提取得到，其氨基酸序列与动物中提取的PSP氨基酸序列不同，表现的功能也不同。本申请从光合细菌PSB06中提取得到的Rhp-PSP蛋白具有易分离，对植株无毒，稳定性高，抗病性强等特点，具有开发成蛋白农药的潜质。(2)本专利技术提供一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的制备方法，利用原核表达技术进行了抗植物病毒基因Rhp-PSP的克隆及诱导表达蛋白；利用镍柱分离纯化获得了Rhp-PSP蛋白，可实现抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的大批量生产，具有生产效率高、生产成本低等优势。(3)本专利技术利用活性测定验证了Rhp-PSP基因表达蛋白的生物学功能，发现Rhp-PSP蛋白在烟草上的抗TMV活性效果非常高，可应用与植物病毒，尤其是烟草花叶病毒中的防治。附图说明为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为采用半叶摩擦法将实施例1的Rhp-PSP接种于心叶烟的效果图。图2为实施例2的步骤2.3中扩增产物凝胶电泳检测结果图。图3为实施例2中步骤3.3中PCR产物凝胶电泳检测结果图。图4为实施例2中步骤3.9中PCR产物凝胶电泳检测结果图。图5为实施例3中步骤(2)中PCR产物凝胶电泳检测结果图。图6为实施例3中步骤(8)中PCR产物凝胶电泳检测结果图。图7为实施例3中对Rhp-PSP蛋白进行SDS-PAGE验证的凝胶电泳图，图8为实施例3中诱导得到的Rhp-PSP蛋白质谱分析结果图。图9为实施例1和实施例3的Rhp-PSP蛋白接种于心叶烟的对比图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本专利技术作进一步描述，但并不因此而限制本专利技术的保护范围。实施例以下实施例中所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1：一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，其获得方法主要包括以下步骤：(1)沉淀蛋白：取光合细菌PSB06富集液，在10000rpm下离心15min。取离心后的上清液8L，置于冰上，往上清液中缓慢加入硫酸铵达到80％饱和度，沉淀过夜，在4℃下以13000rpm离心30min(可重复多次)，取离心后的沉淀即为总蛋白。(2)浓缩蛋白：将步骤(1)中得到的总蛋白加入超滤浓缩离心管中，在10000rpm下离心15min，将总蛋白浓缩至5mg/mL得到浓缩蛋白(尽可能地浓缩到最小量)。(3)蛋白脱盐：将步骤(2)中制备得到的浓缩蛋白于Sephadex.G-25凝胶色谱中层析脱盐，然后用PH＝7.0的0.01M PBS缓冲液进行洗脱，然后浓缩至5mg/mL得到脱盐蛋白。(4)分离纯化蛋白：将步骤(3)中制备得到的脱盐蛋白经过Sephacryl S-100high Reslotution分子筛柱层析纯化，获得不同的纯化蛋白。(5)生物测定：将步骤(4)中获得的不同纯化蛋白分别浓缩或稀释至1000μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗植物病毒蛋白Rhp‑PSP，其特征在于，所述抗植物病毒蛋白Rhp‑PSP的氨基酸序列为以下a和b中的一种：(a)具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；(b)将所述(a)的核苷酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加形成的且具有抗植物病毒活性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，其特征在于，所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的氨基酸
序列为以下a和b中的一种：
(a)具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；
(b)将所述(a)的核苷酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加形成
的且具有抗植物病毒活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，其特征在于，所述抗植物病毒蛋白
Rhp-PSP的编码基因为以下(1)和(2)中的一种：
(1)具有SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；
(2)与所述(1)的核苷酸系列具有90％以上同源性且编码所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP
的核苷酸序列。
3.一种权利要求1或2中所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的制备方法，其特征在于，所述
制备方法为：以光合细菌PSB06的总DNA为模板，进行PCR扩增，然后连接载体，获得重
组子。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、从PSB06菌液中提取PSB06总DNA；
S2、以所述PSB06总DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，张德咏，苏品，冯推紫，张松柏，张卓，彭静，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43