检测人ATP7B基因突变型的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测人ATP7B基因突变型的试剂盒和方法。所述试剂盒包括PCR扩增引物、质谱延伸引物和MassARRAY芯片。所述方法包括1)PCR扩增引物的制备；2)质谱延伸引物的制备；3)检测模板的制备；4)PCR扩增以获得靶序列扩增产物；5)SAP酶处理；6)通过延伸反应得到延伸产物；7)纯化；8)飞行时间质谱检测。本发明专利技术的试剂盒和方法能够同时准确检测出ATP7B基因突变位点，具有高通量、自动化、低成本的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及多重PCR扩增技术和飞行时间质谱基 因分型系统（MassArray)领域。更具体而言，本专利技术涉及一种检测人ATP7B基因突变型的 方法和试剂盒。
技术介绍
肝豆状核变性（Hepatolenticular degeneration，HLD)又名 Wilson 病（Wilson's disease，WD)，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，不同人群的发病率约为15~ 30/100万，其基因定位于13ql4. 3, cDNA编码一种由1465个氨基酸组成的分子量约165Kda 的 P 型铜转运 ATP 酶（copper-transporting P-type ATPase, ATP7B)。WD 患者由于 ATP7B 基因突变使位于肝细胞高尔基反面网状结构（trans-Golgi network, TGN)及胆管膜侧的 ATP7B酶功能缺陷，引起铜离子跨膜转运障碍，导致铜蓝蛋白（ceruloplasmin, CP)合成障 碍及胆汁中铜的排泄受限，过量的铜不能排泄出体外而在肝、脑、肾、角膜等部位沉积并引 起相应的组织脏器损伤，患者可能出现血清CP水平减低、肝硬化、神经/精神症状、角膜K-F 环等临床表现。WD是少数可以治疗的神经遗传病之一，患者如果能在发病早期或症状前期 被确诊并得到及时治疗，大多预后良好，反之病情逐渐加重甚至危及生命。但由于铜在不同 脏器中沉积的速度和程度不同，许多患者早期症状复杂多样，极易被误诊为其他疾病，实验 室铜代谢检查等又存在假阳性或假阴性结果，因此本病的早期诊断特别是症状前期和产前 诊断较为困难。长期以来，国内外众多学者一直探索采用各种基因诊断技术对WD患者进行 症状前期及产前诊断。 在WD基因被克隆之前，Figus等即采用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)-家系连锁分析方法对WD家系成员及先证者进行 产前诊断和杂合子的检出。在国内，吴志英、王丽娟等则对位于WD基因内部及其侧翼区的 D13S301、D13S316、D13S133 和 D13S314 等短串联重复序列（short tandem r印eat，STR)进 行连锁分析，证实了该方法的可行性。但这些方法所用的DNA遗传标记与WD基因距离较远， 重组率高，且必须与同一家系的先证者进行比较，因此不能对无 WD家族史或家系中先证者 已死亡的可疑W)患者进行诊断。2007年，Gupta等选择了 4个WD基因的单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymorphism, SNP)位点对印度人WD家系进行检测，在17个WD家系 的28例患者中有25例与上述SNP位点的单倍体型有相关性，其阳性率接近90%。作为第 3代分子遗传标记，SNP具有遗传稳定、重组率低等优点。有学者建议其与RLFP及其他方法 结合起来，可大大提高有先证者的W)患者的基因诊断效率。 随着WD基因的克隆，通过各种基因诊断技术检测ATP7B基因的突变对本病患者进 行症状前期及产前诊断成为可能。1995年，Thomas等采用聚合酶链反应-单链构象多态性 (polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)分 析结合DNA测序技术率先对WD患者进行ATP7B基因突变的研宄，在58例欧洲裔WD患者中 共发现了 25种突变类型，其中第14外显子Hisl069Gln和第18外显子Glyl266Lys有较高 的突变频率。此后多项研宄证实14外显子和18外显子是欧美人WD患者的高频突变热区。 国内多家单位利用该方法对中国人WD基因突变进行研宄，积累了丰富的研宄资料。但该方 法不能明确突变部位和性质，且易出现假阳性或假阴性结果，目前多用于突变的筛选，其最 终结果需经DNA测序来证实。 上世纪90年代末出现的变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)分析技术由于具有快速、敏感、准确且经济的特点，也被用 于WD的基因诊断。Vrabelova等应用该技术结合RLFP和DNA测序等技术对227例东欧人 WD患者进行检测，总共发现40种突变和18种多态，检出率达80. 3%。国内杨静芳等采用 该方法对74例中国WD患者进行了检测，共发现22种突变和11种多态，经DNA测序证实其 符合率为100%。但该方法与SSCP同样不能明确突变部位和性质，故仅适用于大样本筛查 已知或未知突变。 由于能明确突变的具体部位和性质，对W)基因进彳丁 DNA序列分析是目如最准确、 可靠的方法，是W)基因诊断的"金标准"。Waldenstrom等应用多管并行测序（Manifold Sequencing)技术在24个瑞典人WD家系中共发现16种突变，其中10种为新的发现。国内多 家研宄单位采用DNA测序技术发现WD基因第8外显子Arg778Leu和第12外显子Thr935Leu 突变频率较高，为中国人的突变热点。吴志英等对65个家系的84例中国WD患者的所有 21个外显子进行测序，共检测到18种突变和17种多态，其中包括7种新突变和5种新多 态，并认为我国WD基因突变是以少数几个热点突变和广泛存在的罕见突变为特征。但该方 法对人员、设备要求高，难于在一般医院中推广应用；且WD基因全长约80kb，各外显子突变 形式多种多样，对所有外显子逐一进行测序分析花费高、周期长，一般患者难以承受。大量 研宄结果证实，WD基因存在高度的遗传异质性，各外显子的突变位点众多，目前已发现超过 300种形式的基因突变，且多为复合杂合突变，常见突变形式少见，多为罕见突变，在不同人 种的突变特征亦存在明显差异。这虽然解释了 WD患者临床表现复杂多样的原因，但给基因 诊断走向临床实用带来了困难。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术结合MassArray分子量阵列技术、 引物延伸反应和MALDI-T0F质谱技术扩增相应人群的突变热区并进行序列比对分析，实现 了高准确率和性价比的基因型检测，从而克服了上述技术问题。 本专利技术的一个目的是提供一种检测基因突变型（特别是人ATP7B的基因突变型） 的方法。 本专利技术的另一个目的是提供一种检测基因突变型（特别是人ATP7B的基因突变 型）的试剂盒。 为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 根据本专利技术的一个方面，提供一种检测基因突变型的方法，所述方法包括： 1)PCR扩增引物的制备：PCR扩增引物为根据所选择的待检测的基因突变型设计 的特异性针对每种突变位点的扩增引物，所述PCR扩增引物可扩增包括突变位点在内的一 段DNA序列；所述PCR扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个 碱基，在5'端具有长度为5-15个碱基的标签序列，以区分所述PCR扩增引物与质谱延伸引 物； 2)质谱延伸引物的制备：质谱延伸引物的长度为17-28个碱基并且其3'端位于 基因突变位点的上一个碱基，质谱延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测基因突变型的试剂盒，该试剂盒包括以下成分：PCR扩增引物、质谱延伸引物和MassARRAY芯片。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程楠，王训，韩永升，韩咏竹，
申请(专利权)人：安徽中医药大学神经病学研究所附属医院，
类型：发明
国别省市：安徽;34