除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途制造技术

本发明专利技术涉及一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，除草剂抗性蛋白质包括：(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有除草剂抗性活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明专利技术除草剂抗性蛋白质特别适合在植物中表达，对除草剂抗性广，尤其苯氧基生长素除草剂。

【技术实现步骤摘要】
除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途
本专利技术涉及一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，特别是涉及一种对2,4-D具有抗性的蛋白质、其编码基因及用途。
技术介绍
杂草可以迅速耗尽土壤中作物和其它目的植物所需要的有价值的养分。目前有许多类型的除草剂用于控制杂草，一种特别流行的除草剂是草甘膦。已经开发了对草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、棉花、甜菜、小麦和水稻等。因此可以对种植草甘膦抗性作物的田地喷洒草甘膦以控制杂草而不显著损害作物。草甘膦已经在全球广泛使用超过20年，由此导致对草甘膦和草甘膦耐性作物技术的过度依赖，并在野生杂草物种中对草甘膦天然更具耐受性或已经发展出抗草甘膦活性的植物施加了高选择压。已报道有少数杂草已发展出对草甘膦的抗性，包括阔叶杂草和禾本科杂草，如瑞士黑麦草、多花黑麦草、牛筋草、豚草、小飞蓬、野塘蒿和长叶车前。此外，在广泛使用草甘膦耐性作物之前并不是农业问题的杂草也逐渐盛行，并且难于用草甘膦耐性作物控制，这些杂草主要与(但不仅与)难于控制的阔叶杂草一起出现，如苋属、藜属、蒲公英属和鸭跖草科物种。在草甘膦抗性杂草或难于控制的杂草物种的地区，种植者可以通过罐混或换用能控制遗漏杂草的其它除草剂来弥补草甘膦的弱点。在多数情况下控制阔叶杂草的一种流行且有效的罐混伴侣为2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。2,4-D已经在农业和非作物条件下用于广谱阔叶杂草控制超过65年，仍是全球最广泛使用的除草剂之一。对进一步使用2,4-D的限制在于它在双子叶植物(如大豆或棉花)中的选择性非常低，因此2,4-D一般不用于(且一般不靠近)敏感性双子叶作物。此外，2,4-D在禾本科作物中的用途在某种程度上受限于可能出现的作物损伤的性质。2,4-D和草甘膦的组合已经用于在种植免耕大豆和棉花之前提供更强的灭生处理，然而，由于这些双子叶物种对2,4-D的敏感性，这些灭生处理必须在种植前14-30天进行。和MCPA、2-甲-4-氯丙酸和2,4-D丙酸一样，2,4-D是苯氧酸类除草剂。2,4-D用于在许多单子叶作物(如玉米、小麦和水稻)中选择性控制阔叶杂草而不严重损伤目的作物。2,4-D是合成的植物生长素衍生物，其作用为使正常的细胞激素内稳态失调，并阻碍平衡的受控生长。2,4-D对某些植物具有不同水平的选择性(如双子叶植物比禾本科植物更敏感)。不同植物对2,4-D的不同代谢是不同水平选择性的一种解释。通常植物缓慢代谢2,4-D，因此靶位点的不同活性更可能解释植物对2,4-D不同的应答。2,4-D的植物代谢一般通过两步代谢实现，一般是羟基化后接着与氨基酸或葡萄糖缀合。随着时间的发展，微生物种群已经发展出降解此特定外来物的有效的替代途径，所述途径引起2,4-D的完全矿化。对微生物连续应用除草剂可用来选择能利用除草剂作为碳源用于生长(从而使其在土壤中具有竞争优势)的微生物。因为这个原因，目前将2,4-D配制为具有相对短的土壤半衰期，并且对其后的作物没有遇到明显的遗留效应。这促进了2,4-D的除草剂应用。已经广泛研究了其降解2,4-D能力的一种生物是真养雷氏菌(Ralstoniaeutropha)。编码矿化途径中的第一个酶促步骤的基因为tfdA。TfdA通过α酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2,4-D酸转化成二氯苯酚(DCP)。DCP与2,4-D相比几乎不具有除草剂活性。TfdA在转基因植物中用于向通常对2,4-D敏感的双子叶植物(如棉花和烟草)中输入2,4-D抗性。已在环境中鉴定了大量编码能降解2,4-D的蛋白质的tfdA型基因。许多同系物与tfdA类似(氨基酸同一性>85％)并具有与tfdA相似的酶活性。然而，不是所有具有TauD等结构域的蛋白质都具有2,4-D降解功能，并且有大量同系物与tfdA具有显著更低的同一性(25-50％)，但却具有与α酮戊二酸依赖性双加氧酶Fe+2双加氧酶相关的特征残基。因此这些不同的双加氧酶的底物特异性是什么并不明确。与tfdA具有低同源性(氨基酸同一性28％)的独特实例是来自Sphingobiumherbicidovorans的rdpA。已经显示此酶催化(R)-2,4-D丙酸(和其它(R)-苯氧丙酸)以及2,4-D(苯氧乙酸)矿化的第一步。随着草甘膦抗性杂草的出现和2,4-D除草剂的扩大应用，需要对2,4-D敏感的目的植物中输入2,4-D抗性。目前未发现24DT21除草剂抗性蛋白在植物中的表达水平和对除草剂的耐受性报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，本专利技术旨在提供一种新的24DT21基因，所述24DT21蛋白在植物中对除草剂具有较高的耐受性。为实现上述目的，本专利技术提供了一种除草剂抗性蛋白质，包括：(a)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。为实现上述目的，本专利技术提供了一种除草剂抗性基因，包括：(a)编码所述除草剂抗性蛋白质的核苷酸序列；或(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或(c)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述除草剂抗性基因。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒的重组载体。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种产生除草剂抗性蛋白质的方法，包括：获得包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒的转基因宿主生物的细胞；在允许产生除草剂抗性蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；回收所述除草剂抗性蛋白质。进一步地，所述转基因宿主生物包括植物、动物、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。优选地，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种增加耐受除草剂范围的方法，包括：将所述除草剂抗性蛋白质或所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质在植物中与至少一种不同于所述除草剂抗性蛋白质或所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质的第二种核苷酸一起表达。进一步地，所述第二种核苷酸编码草甘膦抗性蛋白质、草铵膦抗性蛋白质、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。在本专利技术中，24DT21除草剂抗性蛋白质在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个草甘膦抗性蛋白质和/或草铵膦抗性蛋白质的表达。这种超过一种的除草剂抗性蛋白质在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第1亲本)可以通过遗传工程操作表达24DT21除草剂抗性蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达草甘膦抗性蛋白质和/或草铵膦抗性蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种选择转化的植物细胞的方法，包括：用所述除草剂抗性基因或所述表达盒转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种除草剂抗性蛋白质，其特征在于，包括：(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种除草剂抗性蛋白质，其特征在于，如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。2.一种除草剂抗性基因，其特征在于，为：(a)编码权利要求1所述除草剂抗性蛋白质的核苷酸序列；或(b)与(a)限定的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；或(c)如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。3.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求2所述除草剂抗性基因。4.一种包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒的重组载体。5.一种产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，包括：获得包含权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒的转基因宿主生物的细胞；在允许产生除草剂抗性蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；回收所述除草剂抗性蛋白质。6.根据权利要求5所述产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，所述转基因宿主生物包括植物、动物、细菌、酵母、杆状病毒或藻类。7.根据权利要求6所述产生除草剂抗性蛋白质的方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。8.一种增加耐受除草剂范围的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述除草剂抗性蛋白质或权利要求3所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质在植物中与至少一种不同于权利要求1所述除草剂抗性蛋白质或权利要求3所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质的第二种核苷酸一起表达。9.根据权利要求8所述增加耐受除草剂范围的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸编码草甘膦抗性蛋白质、草铵膦抗性蛋白质、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。10.一种选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，包括：用权利要求2所述除草剂抗性基因或权利要求3所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述除草剂抗性基因或所述表达盒的转化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞，所述除草...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶青，吴业春，牛晓广，丁德荣，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心，
类型：发明
国别省市：北京;11