经改良的抗GDF-8的拮抗剂抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供经改良的中和性抗GDF-8抗体，其能在宿主细胞中以显著高于先前抗GDF-8抗体的水平表达。本发明专利技术还提供使用包含这些抗体的组合物增加肌肉质量或强度及治疗或预防肌肉病症、神经肌肉病症、代谢紊乱、脂肪组织病症或骨病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经改良的抗GDF-8的拮抗剂抗体及其用途相关申请的交叉引用本申请主张2012年6月15日申请的美国临时申请第61/660,232号的权益，所述申请的内容以引用方式全文并入本文中。序列表引用在37CFR§1.821下以计算机可读取形式(CRF)经由EFS-Web以文件名PC071914_SEQLIST_ST25.txt同时提交的序列表以引用方式并入本文中。序列表的电子副本于2013年5月14日创建，文件大小为71KB。生物保藏本专利技术的代表性材料于2012年6月14日保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，“ATCC”)，学院大道(UniversityBoulevard)10801号，马纳萨斯，VA20110-2209，美国。具有ATCC登录号PTA-12980的载体OGD1.0.0-HC是编码OGD1.0.0重链可变区的多核苷酸，具有ATCC登录号PTA-12981的载体OGD1.0.0-LC是编码OGD1.0.0轻链可变区的多核苷酸。保藏物在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其下条例(“布达佩斯条约”)的规定下制备。这保证可将保藏物的活培养物自保藏的日起维持30年。根据布达佩斯条约条款将使保藏物可由ATCC获得且使其遵守Pfizer公司与ATCC之间的协议，其保证公众可基于相关美国专利的发布或基于向公众公开任何美国或外国专利申请(以先达到者为准)永久且不受限制地获得保藏培养物的后代，且保证由美国专利商标局根据35U.S.C.§122和依据35U.S.C.§122的委员会规则(包括37CFR§1.14，尤其参照886OG638)确定授权者可获得所述后代。本申请的专利权人已同意，若所保藏材料的培养物当在适宜条件下培养时死亡或丢失或被破坏，则将迅速更换所述材料的另一培养物并作出通知。所保藏材料的可获得性不应视为允许在违反任何政府机关根据其专利法授予的权利的情况下实践本专利技术。
技术介绍
生长分化因子-8(GDF-8)也称作肌肉生长抑制素(myostatin)，是分泌蛋白及结构相关生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员。该超家族的成员具有生长调节及形态发生性质(Kingsley等人(1994)GenesDev.8:133-46；Hoodless等人(1998)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.228:235-72)。人类GDF-8是以375个氨基酸的前体蛋白质来合成，其形成同型二聚体复合体。在处理期间，称为“阴性相关肽”(LAP)的氨基末端前肽被切割且可与所述同型二聚体保持非共价结合，从而形成名为“小潜伏复合体”的无活性复合体(Miyazono等人(1988)J.Biol.Chem.263:6407-15；Wakefield等人(1988)J.Biol.Chem.263:7646-54；Brown等人(1999)GrowthFactors3:35-43；Thies等人(2001)GrowthFactors18:251-59；Gentry等人(1990)Biochemistry29:6851-57；Derynck等人(1995)Nature316:701-05；Massague(1990)Ann.Rev.CellBiol.12:597-641)。诸如促滤泡素抑制素(follistatin)及其相关物的蛋白质也结合成熟GDF-8同型二聚体且抑制GDF-8生物活性(Gamer等人(1999)Dev.Biol.208:222-32)。来自不同物种的推断GDF-8氨基酸序列的比对显示，GDF-8非常保守(McPherron等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12457-61)。人类、小鼠、大鼠、猪及鸡GDF-8的序列在C末端区100％相同，而狒狒、牛及羊GDF-8在C末端处仅相差3个氨基酸。GDF-8在物种之间的高保守度表明，GDF-8具有必需的生理功能。已显示GDF-8可通过抑制成肌细胞及卫星细胞的增殖及分化在肌肉发育调节及体内稳态中起重要作用(LeeandMcPherron(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:604-07；McCroskery等人(2003)J.Cell.Biol.162:1135-47)。其早期在发育中的骨骼肌中表达，且继续在成年骨骼肌中表达，优先在快缩类型中表达。另外，在成年小鼠中过表达的GDF-8造成显著肌肉损失(Zimmers等人(2002)Science296:1486-88)。同样，已显示使GDF-8基因无活性的天然突变在动物及人类中可引起肥大及增生(Lee及McPherron(1997)，见上文)。例如，GDF-8敲除转基因小鼠的特征在于骨骼肌的显著肥大及增生以及改变的骨皮质结构(McPherron等人(1997)Nature387:83-90；Hamrick等人(2000)Bone27:343-49)。在天然GDF-8突变的牛中显现类似的骨骼肌质量增加(Ashmore等人(1974)Growth38:501-07；Swatland等人(1994)J.Anim.Sci.38:752-57；McPherron等人，见上文；Kambadur等人(1997)GenomeRes.7:910-15)。另外，不同研究显示，增加的GDF-8表达与HIV诱导的肌肉耗损有关(Gonzalez-Cadavid等人(1998)Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.95:14938-43)。也已显示GDF-8参与肌肉特异性酶(例如，肌酸激酶)的产生及成肌细胞增殖(WO00/43781)。除了其生长调节及形态发生性质以外，GDF-8据信参与多种其它生理过程，包括在2型糖尿病发展期间的葡萄糖体内稳态、葡萄糖耐量降低、代谢综合征(即，例如综合征X的综合征，其涉及同时发生一组健康状况，所述状况可包括胰岛素抵抗、腹部肥胖症、血脂异常、高血压、慢性炎症、趋血栓阻塞性状态等，其使个人具有2型糖尿病和/或心脏病的高风险)、胰岛素抵抗(例如，由诸如创伤或氮失调症等创伤诱导的抗性)及脂肪组织病症(例如，肥胖症、血脂异常、非酒精性脂肪肝疾病等)(Kim等人(2000)Biochem.Biophys.Res.Comm.281:902-06)。多种人类及动物病症与肌肉组织功能受损有关，例如，肌萎缩侧索硬化症(“ALS”)、肌营养不良(“MD”；包括杜兴肌营养不良(Duchenne'smusculardystrophy))、肌萎缩、器官萎缩、衰弱症、充血阻塞性肺病(COPD)、少肌症、恶病质及由其它疾病及状况引起的肌肉耗损综合征。目前，几乎没有可靠或有效的疗法可治疗这些病症。这些疾病的病理表明GDF-8信号传导在这些疾病的治疗中作为靶的潜在作用。ALS是迟发且致死的神经变性疾病，其特征在于中枢神经系统变性及肌萎缩。ALS通常始于步态异常及灵活性损失，然后进展至肢体及膈膜瘫痪。尽管大多数ALS病例是散发性的且病因未知，但已显示5-10％病例源自显性家族性(FALS)遗传。约10-20％的FALS病例归因于Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因中的突变(综述于Bru本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性结合GDF‑8的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段包含：抗体重链可变(VH)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:44限定的所述VH区的第一、第二及第三互补决定区(CDR)；及抗体轻链可变(VL)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:46限定的所述VL区的第一、第二及第三互补决定区(CDR)；其中所述VH区在对应于SEQ ID NO:44的残基编号111(Kabat位置108)的氨基酸位置处包含亮氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.15 US 61/660,2321.特异性结合GDF-8的抗体，所述抗体包含：抗体重链可变(VH)区，其中VHCDR1由SEQIDNO:10或SEQIDNO:20组成，VHCDR2由SEQIDNO:11或SEQIDNO:21组成，VHCDR3由SEQIDNO:12组成；及抗体轻链可变(VL)区，其中VLCDR1由SEQIDNO:13组成，VLCDR2由SEQIDNO:14组成，VLCDR3由SEQIDNO:15组成；其中在所述VH区中，对应于SEQIDNO:44的残基编号111(Kabat位置108)的氨基酸位置是亮氨酸。2.权利要求1的抗体，其中所述VH区的第四框架区(FR4)包含SEQIDNO:44的氨基酸106至116。3.权利要求1的抗体，其中在所述VL区中，对应于SEQIDNO:46的残基编号100(Kabat位置100)的氨基酸位置是甘氨酸。4.权利要求1的抗体，其中在所述VL区中，对应于SEQIDNO:46的残基编号100(Kabat位置100)的氨基酸位置是谷氨酰胺。5.权利要求3的抗体，其中所述VL区的第四框架区包含SEQIDNO:46的氨基酸98至107。6.权利要求4的抗体，其中所述VL区的第四框架区包含SEQIDNO:9的氨基酸98至107。7.权利要求1的抗体，其中所述VH区由氨基酸序列SEQIDNO:44组成。8.权利要求7的抗体，其中所述VL区由氨基酸序列SEQIDNO:46组成。9.权利要求7的抗体，其中所述VL区由氨基酸序列SEQIDNO:9组成。10.权利要求1的抗体，其进一步包含衍生自选自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体亚型的抗体重链恒定(CH)区。11.权利要求10的抗体，其中所述IgG亚型进一步选自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。12.权利要求11的抗体，其中所述IgG亚型是IgG1。13.权利要求10的抗体，其中所述抗体的重链包含氨基酸序列SEQIDNO:57。14.权利要求1的抗体，其进一步包含抗体轻链恒定(CL)区。15.权利要求14的抗体，其中所述CL区是κ或λCL区。16.权利要求14的抗体，其中所述抗体的轻链包含氨基酸序列SEQIDNO:17。17.权利要求7的抗体，其中所述VH区是由核酸序列SEQIDNO:43编码。18.权利要求1的抗体，其中所述抗体以至少10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M或10-11M的Kd结合GDF-8。19.权利要求1的抗体，其中所述抗体选自Fab、F(ab’)2、scFv、scFv-Fc、scFv-CH、scFab、scFv-拉链、双抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、Fv及双特异性抗体。20.权利要求1的抗体，其中由转染细胞产生的所述抗体的量大于在类似条件下产生的其中VH区中Kabat位置108的氨基酸是甲硫氨酸的其它方面均相同的抗体的量。21.权利要求20的抗体，其中由转染细胞产生的所述抗体的量超过在类似条件下产生的所述其它方面均相同的抗体的量至少以下的量：1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍及30倍。22.特异性结合GDF-8的抗体，所述抗体包含：由氨基酸序列SEQIDNO:44组成的VH区，及由氨基酸序列SEQIDNO:46组成的VL区，其中Kabat位置108的氨基酸是亮氨酸。23.特异性结合GDF-8的抗体，其包含由氨基酸序列SEQIDNO:58限定的抗体重链及由氨基酸序列SEQIDNO:59限定的抗体轻链。24.权利要求23的抗体，其中所述抗体由两条各自由氨基酸序列SEQIDNO:58限定的抗体重链及两条各自由氨基酸序列SEQIDNO:59限定的抗体轻链组成。25.药物组合物，其包含权利要求1的抗体及药物学可接受的载体。26.分离多核苷酸，其包含编码特异性结合GDF-8的抗体的重链和轻链二者的核酸序列，所述抗体包含：抗体重链可变(VH)区，其中VHCDR1由SEQIDNO:10或SEQIDNO:20组成，VHCDR2由SEQIDNO:11或SEQIDNO:21组成，VHCDR3由SEQIDNO:12组成，其中在所述VH区中，对应于SEQIDNO:44的残基编号111(Kabat位置108)的氨基酸位置是亮氨酸；及抗体轻链可变(VL)区，其中VLCDR1由SEQIDNO:13组成，VLCDR2由SEQIDNO:14组成，VLCDR3由SEQIDNO:15组成，其中在所述VL区中，对应于SEQIDNO:46的残基编号100(Kaba...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·R·阿普加，M·M·马德，K·D·帕理什，
申请(专利权)人：辉瑞公司，
类型：发明
国别省市：美国;US