蛋白质表面重建制造技术

本发明专利技术涉及蛋白质表面重建。聚集是蛋白质不良表现的主要原因。本发明专利技术提供一种修饰蛋白质以产生更稳定的变异体的系统。所述方法包括鉴别蛋白质表面上适合于突变为更亲水的残基(例如，带电氨基酸)的非保守疏水性氨基酸残基。可改变表面上任何数目的残基来产生更可溶、抗聚集、重折叠能力更高和/或在多种条件下更稳定的变异体。本发明专利技术还提供本发明专利技术技术所产生的理论净电荷增加的GFP、链霉亲和素以及GST变异体。还提供用于对任何所关注蛋白质进行所述修饰的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质表面重建 本申请是申请日为2007年6月1日、申请号为200780027139. 3、专利技术名称为蛋 白质表面重建的专利技术专利申请的分案申请。 相关申请案 本申请案根据35U. S. C. § 119(e)主张2006年6月2日申请的美国临时专利申请 案USSN 60/810,364的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文中。 政府支持 本文中所述的研究部分得到美国国立卫生研究院（National Institutes of Health)基金（GM065400)的支持。美国政府可具有本专利技术的某些权利。
无
技术介绍
蛋白质是细胞的主要组成成分。蛋白质催化化学反应，在生物系统中转导信号，在 细胞和细胞外基质中提供结构元件，充当信使等。蛋白质不良表现的主要原因之一是聚集。 这不仅是实验室中的问题，而且是诸如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease)等许多疾病 的问题。在达到计算设计的蛋白质时，聚集是尤其烦恼的问题。举例来说，T0P7是具有新 颖折叠的计算设计的蛋白质。T0P7的较长形式（延长的T0P7(T0P7extended))极易聚集。 T0P7ex主要表达为不可溶的聚集体。 随着更多蛋白质被设计或修饰以用作研究生物系统的工具或随着更多野生型或 修饰蛋白质被用作治疗剂，需要常规上将这些蛋白质修饰为更稳定和/或防止聚集的系 统。
技术实现思路
本专利技术提供一种修饰蛋白质以使其更稳定的系统。本专利技术的产生是基于对修饰蛋 白质表面上的疏水性区域可提高蛋白质的超热力学性质的认识。本专利技术系统尤其适用于提 高所关注蛋白质的溶解性，提高蛋白质的抗聚集性，和/或提高蛋白质的复性能力。所有这 些特性尤其适用于蛋白质生产、蛋白质纯化以及使用蛋白质作为治疗剂和研究工具。 在一方面，本专利技术提供一种改变蛋白质的一级序列以增加宽范围条件下蛋白质的 抗聚集性、溶解性、重折叠能力和/或总体稳定性的方法。修饰蛋白质的活性优选大致或 大体上与未修饰的蛋白质相同。在某些实施例中，修饰蛋白质保留至少50%、75%、90%或 95%的野生型蛋白质的活性。在一实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)鉴别所关注蛋白 质的表面残基；(b)鉴别特定表面残基在与所关注蛋白质相关的其它蛋白质中是非高度保 守的（即，确定哪些氨基酸对蛋白质活性或功能来说不是不可缺少的）；(c)确定所鉴别的 非保守表面残基的疏水性；以及（e)用在生理pH值下极性更高或带电的氨基酸置换至少一 个或一个以上所鉴别的疏水性非保守残基。各以上步骤均可以使用所属领域中已知的任何 技术、计算机软件、算法、范式等进行。产生修饰蛋白质后，可测试其活性和/或所寻求的预 期性质。在某些实施例中，修饰蛋白质更加稳定。在某些实施例中，修饰蛋白质不易聚集。 本专利技术方法通常增加在生理PH值下蛋白质的净电荷（正或负）。 在另一方面，本专利技术提供一种通过使蛋白质超带电（supercharging) 来改变蛋 白质的一级序列以增加宽范围条件下蛋白质的抗聚集性、溶解性、重折叠能力和/或总体 稳定性的方法。也就是说，与野生型蛋白质相比，修饰蛋白质上总的净电荷增加（正电荷或 负电荷）。修饰蛋白质的活性优选大致或大体上与未修饰的蛋白质相同。在某些实施例中， 所述方法包括以下步骤：(a)鉴别所关注蛋白质的表面残基；(b)鉴别特定表面残基在与所 关注蛋白质相关的其它蛋白质中是非高度保守的（即，确定哪些氨基酸对蛋白质活性或功 能来说不是不可缺少的）；（c)确定所鉴别的非保守表面残基的亲水性；以及（e)用在生理 PH值下带电的带电氨基酸置换至少一个或一个以上所鉴别的带电或极性、溶剂暴露非保守 残基。在某些实施例中，为制备带负电的超带电蛋白质，使所鉴别用于修饰的残基突变 为天冬氨酸（Asp)或谷氨酸（Glu)残基。在某些其它实施例中，为制备带正电的超带电 蛋白质，使所鉴别用于修饰的残基突变为赖氨酸（Lys)或精氨酸（Arg)残基。各以上步骤 都可以使用所属领域中已知的任何技术、计算机软件、算法、范式等进行。产生修饰蛋白质 后，可测试其活性和/或所寻求的预期性质。在某些实施例中，修饰蛋白质（超带电蛋白 质）更加稳定。在某些实施例中，修饰蛋白质不易聚集。本专利技术方法通常增加在生理PH 值下蛋白质的净电荷（正或负）。 编入蛋白质数据库（Protein Data Bank, F1DB)中的超过80%的蛋白质的理论净 电荷在± 10范围内。本专利技术所产生的修饰蛋白质通常具有小于-10或大于+10的净电荷。 在某些实施例中，修饰蛋白质具有小于-20或大于+20的净电荷。在某些实施例中，修饰蛋 白质具有小于-30或大于+30的净电荷。在某些实施例中，修饰蛋白质具有小于-40或大 于+40的净电荷。在某些实施例中，修饰蛋白质具有小于-50或大于+50的净电荷。修饰 蛋白质能够恰当折叠并保留其生物活性。 可使用本专利技术系统修饰任何蛋白质，并且本专利技术系统所产生的蛋白质变异体以及 编码变异蛋白质的多核苷酸或载体和表达变异蛋白质的细胞都视为本专利技术的一部分。已经 使用本专利技术系统产生了数种新颖的绿色突光蛋白（green fluorescent protein，GFP)变异 体。这些变异体保留其荧光性；然而，其在宽范围环境下比GFP的现有形式更稳定。本专利技术 GFP即使经过很长时间和在诱导聚集的环境中也不会聚集，并且即使通过煮沸变性后也能 够重折叠为突光蛋白。也已经使用本专利技术系统产生了新颖的链霉亲和素（streptavidin) 和谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S_transferase，GST)变异体。这些变异体保留其生 物活性并且在加热时仍可溶。本专利技术还包括编码本专利技术GFP、链霉亲和素以及GST蛋白序 列的多核苷酸序列；包括任何这些核苷酸序列的载体；以及包括这样的多核苷酸序列或载 体或表达本专利技术变异体的细胞。在某些实施例中，本专利技术包括过度表达本专利技术变异体的细 菌或其它细胞。本专利技术变异体可用于所属领域已知的多种生物测定中。举例来说，超带电 GFP可用于目前使用GFP作为报告蛋白的任何测定中。 在另一方面，本专利技术提供已经由本专利技术系统修饰的其它蛋白质。这些修饰蛋白质 优选保留其显著比例的初始活性。在某些实施例中，修饰蛋白质保留至少99%、98%、95% 或90%的未修饰形式的活性。修饰蛋白质在多种条件可更可溶，抗聚集，重折叠能力增加和 /或稳定性更高。由本专利技术系统修饰的蛋白质包括疏水性蛋白、重组蛋白、膜蛋白、结构蛋 白、酶、细胞外蛋白、治疗蛋白（例如，胰岛素、细胞激素、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段等）、 受体、细胞信号传导蛋白、胞浆蛋白、核内蛋白、转录因子等。在某些特定实施例中，蛋白质 是用于人类或兽医学的治疗蛋白。在某些实施例中，蛋白质是非天然蛋白质，例如计算设计 的蛋白质。在其它实施例中，蛋白质是杂合蛋白、融合蛋白、变构蛋白、突变蛋白、基因工程 蛋白或已经通过人工改变的任何其它蛋白质。 还提供用于实施本专利技术的试剂盒。试剂盒可包括修饰所关注蛋白质以使其更抗聚 集、增加其复性能力或增加其总体稳定性所需的试剂。这些试剂盒可包括所有或部分以下 各物：多核苷酸、计算机软件、核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种野生型蛋白的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体包括与野生型序列相比经修饰的一级氨基酸序列，导致所述超带电蛋白质变体上的净电荷为：生理pH值下‑10至‑40，其中所述超带电蛋白质变体在生理pH值下所带净电荷比野生型蛋白减小了至少‑3；或生理pH值下+10至+52，其中所述超带电蛋白质变体在生理pH值下所带净电荷比野生型蛋白增加了至少+3；其中所述经修饰的一级氨基酸序列包括用在生理pH值下带正电或带负电的天然氨基酸残基置换多个非保守表面残基；以及其中所述非保守表面残基通过比较所述蛋白质的氨基酸序列与来自同一蛋白质家族或来自不同物种的蛋白质的至少一个其它氨基酸序列来鉴定，其中如果在特定位置上有小于或等于50％的氨基酸序列为相同的氨基酸序列，那么残基就是非保守的。

【技术特征摘要】
2006.06.02 US 60/810,364;2006.08.09 US 60/836,6071. 一种野生型蛋白的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体包括与野生型序 列相比经修饰的一级氨基酸序列，导致所述超带电蛋白质变体上的净电荷为： 生理pH值下-10至-40,其中所述超带电蛋白质变体在生理pH值下所带净电荷比野生 型蛋白减小了至少-3;或 生理pH值下+10至+52，其中所述超带电蛋白质变体在生理pH值下所带净电荷比野生 型蛋白增加了至少+3 ; 其中所述经修饰的一级氨基酸序列包括用在生理pH值下带正电或带负电的天然氨基 酸残基置换多个非保守表面残基；以及 其中所述非保守表面残基通过比较所述蛋白质的氨基酸序列与来自同一蛋白质家族 或来自不同物种的蛋白质的至少一个其它氨基酸序列来鉴定，其中如果在特定位置上有小 于或等于50 %的氨基酸序列为相同的氨基酸序列，那么残基就是非保守的。2. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述变体带正电。3. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述变体带负电。4. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体在生理pH值下 所带净电荷比野生型蛋白增加了至少+4、至少+5、至少+10、至少+15、至少+20、至少+25、 至少+30、或至少+35。5. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体在生理pH值下 所带净电荷比野生型蛋白减小了至少-4、至少-5、至少-10、至少-15、至少-20、至少-25、 至少-30、或至少-35。6. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体在生理pH值下 的净电荷在-40至-20或-40至-30范围内。7. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体在生理pH值下 的净电荷在+52至+20、+52至+30、或+52至+40范围内。8. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体保留野生型蛋 白的至少50%、至少75%、至少90%、或至少95%的活性。9. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述野生型蛋白是免疫球蛋白或其片 段。10. 如权利要求9所述的超带电蛋白质变体，其中所述免疫球蛋白或其片段是人类的 或是人源化的。11. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述变体是融合蛋白。12. 如权利要求11所述的超带电蛋白质变体，其中所述融合蛋白包括连接子。13. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体的经修饰的 一级氨基酸序列包括用不同残基置换野生型蛋白的至少一个带电的非保守表面残基。14. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体的经修饰的 一级氨基酸序列包括用不同电荷的残基置换野生型蛋白的至少一个非保守表面残基。15. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体的经修饰的 一级氨基酸序列包括用赖氨酸、组氨酸或精氨酸残基置换野生型蛋白的至少一个非保守表 面残基。16. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体的经修饰的 一级氨基酸序列包括用天冬氨酸或谷氨酸残基置换野生型蛋白的至少一个非保守表面残 基。17. 如权利要求1所述的超带电蛋白质变体，其中所述超带电蛋白质变体的经修饰的 一级氨基酸序列包括用不同残基置换野生型蛋白的至少2个、至少5个、至少10个、至少20 个或至少30个非保守表面残基。18. -种以下氨基酸序列的绿色荧光蛋白（+36GFP): MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK 〇19. 一种多核苷酸，其编码如权利要求18所述的绿色荧光蛋白（+36GFP)。20. 如权利要求19所述的多核苷酸，其序列如下： ATGGGGCATCATCATCATCACCACGGCGGGGCGTCTAAGGGAGAGCGCTTGTTTCGCGGCAAAGTCCCGATT CTTGTGGAGCTCAAAGGTGATGTAAATGGTCATAAATTTAGTGTGCGCGGGAAAGGGAAAGGAGATGCTACGCGGGG CAAGCTCACCCTGAAATTTATTTGCACAACCGGCAAACTGCCAGTGCCGTGGCCTACATTAGTCACTACTCTGACGT ACGGTGTTCAGTGCTTTTCTCGCTATCCCAAACACATGAAACGCCATGATTTCTTCAAGAGCGCGATGCCAAAAGGT TATGTGCAGGAACGCACCATCAGCTTTAAAAAAGACGGCAAATATAAAACCCGTGCAGAAGTTAAATTCGAAGGCCG CACCCTGGTCAACCGCATTAAACTGAAAGGTCGTGACTTCAAAGAGAAAGGTAATATTCTTGGTCACAAACTGCGCT ATAATTTCAACTCTCACAAAGTTTATATTACGGCGGATAAACGTAAAAACGGGATTAAAGCGAAATTTAAGATTCGT CATAATGTTAAAGACGGCAGTGTGCAGTTAGCGGATCATTATCAGCAGAATACCCCAATTGGTCGCGGTCCAGTGCT GCTGCCGCGTAACCATTATCTGTCGACCCGCAGCAAACTCAGCAAAGACCCGAAAGAAAAACGTGACCACATGGTAT TACTGGAATTTGTGACCGCAGCAGGCATTAAACATGGCCGCGATGAACGTTACAAATAG。21. -种载体，其包括如权利要求19或20所述的多核苷酸。22. -种氨基酸序列如下的绿色荧光蛋白（+42GFP): MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVELK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK 〇23. -种多核苷酸，其编码如权利要求22所述的绿色荧光蛋白（+42GFP)。24. 如权利要求23所述的多核苷酸，其序列如下： ATGGGCCATCATCATCACCACCACGGCGGCCGCTCAAAAGGTAAACGCTTGTTCCGTGGTAAAGTACCGATC TTAGTGGAGCTCAAAGGGGATGTGAATGGCCATAAGTTCTCGGTTCGTGGCAAAGGTAAGGGAGATGCGACGCGCGG CAAATTAACGCTGAAATTCATTTGTACTACAGGTAAACTGCCGGTGCCATGGCCTACTCTCGTCACCACGTTGACCT ATGGGGTTCAATGCTTCAGCCGGTACCCTAAACACATGAAGCGCCACGATTTCTTCAAATCGGCGATGCCAAAGGGG TATGTCCAGGAACGCACTATCAGCTTCAAAAAAGACGGTAAGTATAAAACTCGTGCTGAAGTTAAATTCGAAGGACG CACACTGGTAAATCGCATTAAATTGAAGGGGCGCGACTTTAAGGAAAAAGGTAATATCTTAGGTCACAAATTGCGCT ACAACTTCAACTCTCATAAAGTTTACATTACAGCAGATAAGCGTAAAAATGGCATCAAAGCGAAATTCAAAATTCGT CACAATGTGAAAGATGGTAGCGTGCAATTAGCCGATCATTACCAGCAGAATACGCCGATCGGTCGCGGCCCAGTACT GTTGCCGCGCAAACATTACTTATCTACCCGGAGTAAACTGTCTAAAGACCCAAAAGAGAAGCGCGACCATATGGTTC TCCTGGAGTTTGTCACCGCCGCCGGAATTAAACACGGCCGCAAAGAGCGCTATAAATAG。25. -种载体，其包括如权利要求23或24所述的多核苷酸。26. -种氨基酸序列如下的绿色荧光蛋白（+48GFP): MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQ ID N0:24)。27. -种多核苷酸，其编码如权利要求26所述的绿色荧光蛋白（+48GFP)。28. -种载体，其包括如权利要求27所述的多核苷酸。29. -种氨基酸序列如下的绿色荧光蛋白（+49GFP): MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLKEFVTAAGIKHGRKERYK 〇30. -种多核苷酸，其编码如权利要求29所述的绿色荧光蛋白（+49GFP)。31. 如权利要求30所述的多核苷酸，其序列如下： ATGGGCCACCATCATCATCACCACGGGGGACGCTCTAAAGGTAAACGTCTGTTTCGTGGAAAGGTGCCCATT CTGGTTAAACTCAAAGGTGATGTCAACGGCCATAAGTTTTCGGTTCGTGGCAAAGGTAAAGGTGATGCGACGCGCGG GAAATTAACACTGAAATTTATTTGCACAACCGGAAAACTCCCTGTGCCGTGGCCGACTTTGGTGACCACATTAACCT ATGGTGTTCAATGCTTCTCACGTTATCCGAAGCATATGAAACGTCATGATTTTTTCAAATCGGCTATGCCGAAAGGT TACGTCCAGGAGCGCACCATCTCATTTAAGAAAGACGGTAAGTATAAAACCCGTGCTGAAGTAAAATTCAAAGGACG CACCCTGGTGAATCGCATTAAACTGAAAGGTCGTGATTTCAAAGAAAAGGGAAATATTTTAGGGCATAAGCTCCGTT ATAATTTTAACAGTCATAAGGTGTATATTACCGCTGATAAACGCAAAAACGGAATCAAAGCGAAATTTAAGATCCGT CATAATGTAAAAGATGGCTCAGTCCAACTGGCAAAACATTACCAGCAGAATACCCCGATCGGCCGCGGTCCTGTGCT TCTGCCGCGTAAACACTACTTGTCGACCCGGTCAAAATTGAGTAAAGATCCGAAGGAAAAGCGTGATCACATGGTCT TGAAGGAATTTGTAACTGCAGCAGGTATTAAACACGGGCGCAAAGAACGTTACAAATAG〇32. -种载体，其包括如权利要求30或31所述的多核苷酸。33. -种链霉亲和素（+52SAV)，其包括以下氨基酸序列： MGHHHHHHGGAKAGITGTWYNQLGSTFIVTAGAKGALTGTYESAVGNAKSRYVLTGRYDSAPATKGSGTALGW TVAWKNKYRNAHSATTWSGQYVGGAKARINTQWLLTSGTTKAKAffKSTLVGHDTFTKVKPSAASo34. -种多核苷酸，其编码如权利要求33所述的链霉亲和素（+52SAV)。35. 如权利要求34所述的多核苷酸，其序列如下： GGTTCAGCCATGGGTCATCACCACCACCATCACGGTGGCGCCAAAGCAGGTATTACCGGTACCTGGTATAAC CAGTTAGGCTCAACCTTTATTGTGACCGCGGGAGCGAAAGGCGCCTTAACCGGTACCTACGAATCAGCTGTAGGAAA CGCAAAATCACGCTACGTATTAACCGGTCGTTATGATAGCGCGCCGGCGACTAAAGGTAGCGGTACTGCTTTAGGTT GGACCGTAGCGTGGAAGAATAAGTATCGTAATGCGCACAGTGCTACCACTTGGTCAGGGCAGTACGTAGGGGGAGCC AAAGCACGTATCAACACGCAGTGGTTATTAACATCAGGTACCACCAAAGCGAAAGCCTGGAAGAGCACGTTAGTGGG TCATGATACCTTCACTAAAGTGAAACCTTCAGCTGCGTCATAATAATGACTCGAGACCTGCA。36. -种载体，其包括如权利要求34或35所述的多核苷酸。37. -种氨基酸序列如下的谷胱甘肽-S-转移酶（+50GST): MGHHHHHHGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·R·刘，凯文·约翰·菲利普斯，迈克尔·S·劳伦斯，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：美国;US