分型诊断四种感染人疟原虫的探针、试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于诊断四种感染人疟原虫的探针、试剂盒及其使用方法。其中，恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫分别采用对应的种特异性探针，探针5’端均加有10个T尾，紫外交联固定于尼龙杂交膜。所述试剂盒由PCR和反向斑点杂交反应试剂及材料构成，可在室温下进行恶性疟原虫、问日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或者其中的两种或者三种或者四种疟原虫的分型诊断，提供了一种简便、快速的疟原虫分型诊断技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于疟原虫分型诊断的探针、试剂盒及其使用方法，尤其涉及一种用于诊断恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫的探针及其试剂盒和使用方法，属于疟原虫检测领域。
技术介绍
疟原虫是原生动物门、孢子虫纲(Sporozoa)，球虫目(Cocciidea)，血孢子虫亚目(Haemosporidiidea)，原虫科(Plasmadiidea)中的一个属，即疟原虫属(plasmodiam)的总称。寄生于人体者包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovals)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)四种。我国以间日疟分布最广，除青藏高原外，遍及全国。恶性疟次之，分布于秦岭一淮河以南，以云贵、两广与海南为最。三日疟在长江南北各省均有散在病例。卵形疟只在云南和广东有少数病例报告。疟疾是对人类健康危害最严重的传染病之一，我国自2000年以来疟疾疫情出现回升，其中云南、海南两省较为严重，许多省受到输入性恶性疟的威胁，尤其是境外输入性恶性疟的威胁。随着经济全球化和国际交往的增多，近年来劳务输出人数逐年增加，输入性疟疾病例逐年增多，呈逐年上升趋势。输入性病例大多源于非洲、缅甸等恶性疟高发区劳务输出的归国人员，2008年我国疟疾死亡病例全部为境外劳务回国人员，2009年有21个省(市、区)有输入性恶性疟病例报告，且疟疾死亡也全部为输入病例。2010年报告输入性恶性疟1161例，占恶性疟报告病例数的92.3％，较2009年(897例)上升29.4％。2012年全国31个省(市、区)有报告疟疾病例，与2011年相比，本地感染疟疾病例明显下降，输入性疟疾病例比例明显上升，尤其是境外输入性疟疾病例比例从2011年的66.4％(2974/4479)上升到2012年的91.0％(2474/2718)，其中以恶性疟为主。因此，关注疟疾疫情，特别是境外输入性恶性疟疫情十分重要。目前，疟疾诊断方法主要分3类：一是以传统的镜检法为基础的病原学诊断，通过增加血样中的原虫数目、改进染色方法或两者结合来提高检测效率，如荧光染色技术等；二是上世纪70年代发展起来的免疫学诊断方法，如间接荧光抗体法、酶联免疫吸附法等，其中免疫层析技术因其快速、简便等特点已成为疟疾诊断的研究热点；三是上世纪80年代兴起的分子生物学诊断方法，通过检测疟原虫种、株特异性的基因片段来确定疟原虫感染，如基因探针和PCR技术等。PCR技术因其高度的敏感性、特异性以及对虫种、虫株的鉴别力在疟疾诊断中发挥越来越重要的作用，套式PCR等方法可进一步提高诊断的敏感性和准确性。但PCR方法仍费力耗时，需要多次试验确定混合感染。如何在一次反应中检测多个虫种、虫株、甚至基因型成为近年来研究的热点。反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是1989年由Saiki等提出的一种斑点杂交技术，并将其应用于血液病和Beta地中海贫血的检测，该方法操作简便，在膜上添加针对不同亚型或突变的探针，可以在一张膜上同时检测多个样品，有利于降低成本，节省时间。RDB只需要相对较短的寡核苷酸探针就能提供明显的杂交信号，通过调整杂交条件可以鉴别出模板中一个碱基的差异。该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳转印杂交具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点，尤其是在基因分型、基因突变检测、病原体的检测等方面有其独特的优势。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一套用于分型诊断疟原虫的探针，可用于恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或者其中的两种或者三种或者四种疟原虫的聚合酶链反应-反向斑点杂交分型诊断。所述探针针对各疟原虫的种特异性片段设计，探针5’端均加有10个T尾，其核苷酸序列为：本专利技术的另一个目的是提供一种用于疟原虫分型诊断的聚合酶链反应-反向斑点杂交试剂盒，包括聚合酶链式反应通用引物溶液(PM)和聚合酶链式反应预混合液(RM)，固定有各种类疟原虫探针的尼龙杂交膜(chip)，室温杂交液(Hyb)，洗液I(W1)，洗液II(W2)，链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(AP)，碱性磷酸酶缓冲液(Buffer1)，显色缓冲液(Buffer2)，显色底物(NBT/BCIP)，其特征在于，所述试剂盒可以在室温条件下进行恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或者其中的两种或者三种或者四种疟原虫的分型诊断。该试剂盒适用标本类型为患者全血基因组DNA等。所述的聚合酶链式反应通用引物溶液(PM)，是由上游引物(5’-3’：GAGGGCAAGTCTGGTGCCAG)与下游引物(5’-3’：CATCTGAATACGAATGTCCCCAAGC)按照1∶1的比例配制而成的，引物5’端均以生物素标记，引物浓度为10μmol/L。所述的固定有分型诊断疟原虫探针的尼龙杂交膜(chip)的制备方法为，用移液器分别吸取四种分型诊断疟原虫探针(SEQ No.1-SEQ No.4)中的至少一种探针0.3-0.5μL点在尼龙膜上，紫外交联后即可用于杂交实验。紫外交联时间设定为15”、30”、1’、1’30”、2’、3’、5’、10’，优选交联时间为5’。改变探针的点样浓度分别为1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L，杂交反应后，通过斑点颜色的深浅确定探针的点样浓度为25-100μmol/L，优选浓度为50μmol/L。本专利技术还提供一种用于分型诊断疟原虫试剂盒的使用方法，其特征在于，包括聚合酶链反应扩增和室温反向斑点杂交诊断两个主要步骤，反向斑点杂交诊断可在室温条件下完成。聚合酶链反应50μL的反应体系包括：聚合酶链反应预混合液(RM)25μL，DEPC水22μL，引物混合液(PM)2μL，DNA模板1μL，阴性对照中以DEPC水代替DNA模板。扩增程序为：94℃，3min；94℃，30s，53℃，30s，72℃，30s，共30个循环；最后在72℃下5min延伸。室温反向斑点杂交诊断方法的具体步骤为：(1)将固定有分型诊断疟原虫探针的尼龙杂交膜置于杂交袋或杂交管内，加入300μL的室温杂交液；(2)带有生物素标记的扩增产物95℃变性5min，迅速冰浴2min；(3)向室温杂交液中加入30μL变性扩增产物，室温杂交3hr；(4)弃去杂交液，洗液I、洗液II各洗涤2次，每次5min；(5)弃去洗液，加入1000倍稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温反应30min；(6)弃去酶液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一套用于分型诊断四种感染人疟原虫的探针，其特征在于，所述探针系针对恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的种特异性片段设计，探针5’端均加有10个T尾，其核苷酸序列为：所述探针可用于恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或者其中的两种或者三种或者四种疟原虫的聚合酶链式反应‑反向斑点杂交分型诊断。

【技术特征摘要】
1.一套用于分型诊断四种感染人疟原虫的探针，其特征在于，所述探针系针对恶性疟原虫、间日
疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的种特异性片段设计，探针5’端均加有10个T尾，其核苷酸序列
为：
所述探针可用于恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或者其中的两种或者三种或者四
种疟原虫的聚合酶链式反应-反向斑点杂交分型诊断。
2.一种用于分型诊断四种感染人疟原虫的试剂盒，其特征在于，包括聚合酶链式反应通用引物溶液
(PM)和聚合酶链式反应预混合液(RM)，固定有各型疟原虫探针的尼龙杂交膜(chip)，室温杂交液(Hyb)，
洗液I(W1)，洗液II(W2)，链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(AP)，碱性磷酸酶缓冲液(Bufferl)，显色缓
冲液(Buffer2)，显色底物(NBT/BCIP)，其特征在于，所述试剂盒可以在室温条件下进行恶性疟原虫、
三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫或者其中的两种或者三种或者四种疟原虫的分型诊断；
所述的聚合酶链式反应通用引物溶液(PM)，其特征在于，引物5’端均以生物素标记，上游引物(5’-3’：
GAGGGCAAGTCTGGTGCCAG)与下游引物(5’-3’：CATCTGAATACGAATGTCCCCAAGC)按照1∶1
的比例配制而成的，引物浓度为10mol/L；所述的固定有各虫种疟原虫探针的尼龙杂交膜(chip)，其特
征在于，固定有如权利要求1所述的四种分型诊断感染人疟原虫探针(SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3、
SEQ No.4)中至少一种探针，各型疟原虫探针的点样浓度为25-100μmol/L，优选浓度为50μmol/L，点样
量为0.3-0.5μL。
3.一种如权利要求2所述的用于分型诊断四种感染人疟原虫的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括

【专利技术属性】
技术研发人员：邹明强，薛强，殷宏，王飞，刘翌，马吉湘，
申请(专利权)人：中检国研北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11