本发明专利技术涉及木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物对及快速PCR检测方法和试剂盒。所述引物对包括引物PMZWMEF1：5′-CTTGATAAAACAGGAATTGAG-3′；和引物PMZWMER1：5′-CCTTTGATGATTTCTTCTTCT-3′。该引物只对木薯绵粉蚧具有扩增能力，对单粒卵、初孵若虫以及成虫残体亦有良好的检测效果。是对木薯绵粉蚧形态学检测鉴定方法的补充和改进。同时，本方法采用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国口岸、木薯生产基地、有机蔬菜和有机水果生产基地、鲜切花生产基地、棉花种植区，以及蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。
【技术实现步骤摘要】
木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物对及快速PCR检测方法和试 剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地，本专利技术涉及木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物 对及快速PCR检测方法和试剂盒。
技术介绍
木薯绵粉阶（Cassava mealybug) Phenacoccus manihoti Matile-Ferrero,属半 翅目、粉蚧科、绵粉蚧属，是一种世界性检疫害虫，2011年6月20日中华人民共和国农业部 和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告将其列入《中华人民共和国进境植物检疫性有 害生物名录》（农业部国家质检总局公告第1600号），并要求各出人境检验检疫机构依法加 强对该虫发生国家或地区寄主植物的检验检疫。木薯绵粉蚧嗜食木薯尤其是甜木薯，并常 在木薯上暴发成灾，而在其寄主植物上迄今尚未有成灾的报道。已有的研究表明，木薯绵粉 蚧的寄主植物有15科27种加3属，包括农作物、园林植物、杂草和果树等，严重受害的植物 有大戟科的木薯、一品红、木薯胶、异叶南洋杉、飞扬草、苦竹等；马齿苋科的菜用土人参、马 齿览等；菊科Aspilla属植物、胜红蓟、金腰箭属的苦草Sydrella 11〇(11打〇以、紫莖泽兰、飞 机草等；椴树科的黄麻属植物；茜草科的伞房花耳草；荨麻科的甜麻；苋科苋属植物；蔷薇 科的木瓜；茄科的番茄、马铃薯、辣椒等；豆科的花生、大豆等；锦葵科的秋葵、棉花等；薯蓣 科薯蓣属的一种植物Dioscera sp.、甘薯等；凤梨科的菠萝；芸香科的柑橘；葫芦科的南瓜 等。而且，随着木薯绵粉蚧入侵区域的逐渐扩大和定居时间的推移，其寄主植物的种类和危 害程度有进一步增加的趋势。木薯绵粉蚧营孤雌生殖，主要以雌性成虫和若虫群居在寄主 植物的幼嫩部位进行刺吸为害，为害部位包括嫩枝、嫩叶、嫩梢、花芽和叶柄以及窖储块根、 块茎等，受害木薯叶片发黄、卷曲、脱落，受害植株长势衰弱，生长缓慢或停滞，失水干枯，亦 可造成叶片大量脱落、生长点丛生、枝条畸形、嫩枝枯死；而成虫和若虫分泌的蜜露诱发的 煤污病不仅严重影响植物的光合作用，还可导致叶片枯萎脱落，严重时可造成植株成片死 亡；此外,木薯绵粉蚧还可传播重大检疫性病原物非洲木薯花叶病毒。如上世纪70年代木 薯绵粉蚧传入非洲刚果，并迅速扩散至非洲所有的木薯种植区，成为非洲木薯的主要害虫， 导致木薯减产84%，每年造成的经济损失高达20亿美元；又如，在我国的邻邦泰国，2009年 初发现木薯绵粉蚧，5月份其危害面积就达16万公顷，仅20个府的损失就有28亿铢（约合 8629. 6万美元），用于防治木薯绵粉蚧的费用达6500万铢（约合200万美元）。 木薯绵粉蚧原产于南美洲中部，是当地木薯上的一种重要害虫，后随寄主植物及 其产品传播扩散，陆续在西非、中非、东非发现，给非洲木薯产业造成巨大损失。2008年（或 许更早）传入泰国，目前已在亚洲的泰国、老挝、柬埔寨、越南、印度尼西亚，非洲的安哥拉、 贝宁、布隆迪、刚果、科特迪瓦、冈比亚、加纳、几内亚、几内亚比绍、肯尼亚、马拉维、莫桑比 克、尼日利亚、卢旺达、塞内加尔、塞拉利昂、苏丹、坦赞尼亚、扎伊尔、中非共和国，南美洲的 阿根廷、玻利维亚、巴西、哥伦比亚、巴拉圭、圭亚那等31个国家和地区严重发生，是威胁世 界木薯生产安全的重大入侵害虫。经多方考证，目前我国尚未发现木薯绵粉蚧，然而，木薯 绵粉蚧在我国广东、广西、海南等省的绝大部分地区以及福建、江西、贵州、云南等省份部分 地区高度适生，在重庆、四川等部分地区中度适生。因此，尽快研发木薯绵粉蚧快速检测技 术，加强对木薯绵粉蚧的监测检测，是保障我国木薯及蔬菜花卉产业和水果、棉花产业健康 发展的必要前提。 木薯绵粉蚧为小型昆虫，营孤雌生殖，雌性成虫卵圆形，活体粉红色，被白色蜡粉， 体长1. 17-2. 37mm ;卵长0· 31-0. 42mm，初孵若虫体长0· 49-0. 75mm，淡粉红色，略微透明，肉 眼难以发现。雌性成虫将卵产于生殖孔附近的棉絮状的卵囊内，初孵若虫活跃，从卵囊爬出 后短时间内即可取食危害，并可迁移至邻近植株。而加强检疫和监测必需建立一套快速准 确的分子检测方法。目前国际上用于木薯绵粉蚧鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定。但 目前国内针对木薯绵粉蚧尚没有任何标准的检测方法，并且基于形态学特征的《木薯绵粉 蚧检疫鉴定方法》的行业标准尚未纳入制定规划。 COI技术曾用于鉴别木薯绵粉蚧的近缘种。mtDNA COI技术检测是利用通用型的 引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序， 根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。SS-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技 术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带 的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现 性好和稳定性强等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物对。 本专利技术的再一目的为提供一种木薯绵粉蚧特异性基因片段。 本专利技术的另一目的为提供一种木薯绵粉蚧的特异性快速PCR检测方法。 本专利技术的再一目的为提供一种木薯绵粉蚧的特异性快速PCR检测试剂盒。 本专利技术根据木薯绵粉蚧的线粒体DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只对 木薯绵粉蚧具有扩增能力。是对木薯绵粉蚧形态学检测鉴定方法的补充和改进。同时，本方 法采用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在木薯绵粉蚧检 测监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、木薯生产基地、有机蔬菜 和有机水果生产基地、鲜切花生产基地，以及蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。 根据本专利技术的一对木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物为： 引物 PMZWMEF1:5，-CTTGATAAAACAGGAATTGAG-3，；和 引物 PMZWMER1 :5' -CCTTTGATGATTTCTTCTTCT-3，。 根据本专利技术的木薯绵粉蚧特异性基因片段的核苷酸序列如PMZWME ID No: 1所示。 根据本专利技术的木薯绵粉蚧种特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行PCR 扩增的步骤。 根据本专利技术的木薯绵粉蚧种特异性检测试剂盒包括上述木薯绵粉蚧特异性 SS-COI 引物。 本专利技术的木薯绵粉蚧种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测木 薯绵粉蚧。与国际现有方法相比，本专利技术具有以下的技术优势： 1)检测准确性高。本方法根据木薯绵粉蚧种特异性SS-COI标记设计的引物 PMZWMEF1和PMZWMER1，在PCR快速检测木薯绵粉蚧时，可扩增出353bp的片段，不仅对木薯 绵粉蚧的单头成虫、2龄和3龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵若虫也能准确检 测。 2)操作简便快捷。本专利技术采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个过 程可在5个小时内完成。 3)特异性强。本专利技术设计的引物可特异性检测木薯绵粉蚧，在其近缘种、属粉蚧中 无扩增产物。 因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测本文档来自技高网...
【技术保护点】
木薯绵粉蚧特异性SS‑COI引物对，其特征在于，所述引物序列为：引物PMZWMEF1：5′‑CTTGATAAAACAGGAATTGAG‑3′；和引物PMZWMER1：5′‑CCTTTGATGATTTCTTCTTCT‑3′。
【技术特征摘要】
1. 木薯绵粉蚧特异性ss-coi引物对，其特征在于，所述引物序列为： 引物 PMZWMEF1 :5' -CTTGATAAAACAGGAATTGAG-3，；和 引物 PMZWMER1 :5' -CCTTTGATGATTTCTTCTTCT-3，。2. -种木薯绵粉蚧特异性基因片段，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张桂芬，王玉生，田虎，万方浩，王瑞，冼晓青，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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